超分辨率显微镜-纳米镜

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体外培养1天的原代海马神经元轴突顶端的生长锥用Abberior仪器专家系列STED显微镜成像。微导管Tuj1(红色,Abberior STAR580)被捆绑在中心区域,提示暂停状态。分子运动肌球蛋白IIB(蓝色)沿着F-肌动蛋白弧在过渡区富集。在外围域中,肌动蛋白在丝状伪足中形成束(鬼笔环肽,Abberior STAR635,绿色)。样品由哥廷根MPIBPC的Elisa D’Este准备的。

光学显微镜是一种功能强大的多用途诊断工具。荧光标记技术,包括免疫组织化学、原位杂交和荧光蛋白标签能够研究细胞器和蛋白质的分布和动力学以及任何感兴趣的基因组序列。然而,传统的显微技术存在空间分辨率低的问题,主要是由于光的衍射。该衍射极限在横向为200-300nm,在轴向为500-700nm。大多数大分子细胞复合物发生在十纳米到几百纳米的尺寸范围内,这是传统光学显微镜所不能达到的。相比之下,电子显微镜可以在细胞中获得更详细的信息,因为它使用加速的电子束。然而,这种技术的实用性在生命科学背景下非常有限,因为它必须在真空中完成。而且技术要求高、成本高、耗时长。因此,为了提高光学分辨率的衍射极限已经使用了各种方法。

超分辨率荧光显微镜技术的发展解决了早期显微镜技术固有的一些困难。然而,在深入研究超分辨率显微镜之前,我们将讨论更早的荧光显微镜技术。

 使用远场和近场技术提高分辨率1

共聚焦多光子激光扫描显微镜都是远场显微镜技术。这两种技术都使用聚焦激光进行激发,并允许增强空间分辨率。共聚焦显微镜使用针孔来减少离焦荧光背景,而多光子显微镜依赖于光子和样品之间的非线性相互作用,引起来自受限焦平面的激发。2此外,第三种远场方法是结构照明显微镜(SIM),它也采用光学方法来提高分辨率。样品场用正弦剥离的光系列图案照射,该图案与样品的空间图案混合,产生干涉图案(称为“莫尔条纹”)。3所得到的光图案可以使用计算机算法提供衍射极限以下的细节。三维立体结构照明显微镜,(3D)-SIM,SIM上的一种变体,已成功用于检查高阶染色质结构,以及C2C12成肌细胞的核孔和核层的定位。4

全内反射荧光(TIRF)显微镜,一种近场技术,用于近表面研究。它使用相对于玻璃介质界面以高度倾斜的角度反射光而产生的渐逝波。渐逝波可在介质中穿透约100nm,并激发存在于样品表面的稀薄区域中的荧光团分子,从而产生高轴向分辨率。用这种技术看不到细胞的内部。扫描近场光学显微镜(SNOM),也被称为近场扫描光学显微镜(NSOM),也利用了渐逝波的特性。受到激光通过狭窄孔径(小于激发光的波长)的激发,所研究的表面在非常接近的范围内被照射。这导致了渐逝波的形成,其横向和轴向限制在20nm以内。荧光可以转换成样品表面的光学图像,其分辨率取决于孔径大小而不是波长。这种技术可以实现50nm或更小的分辨率。然而,与TIRF显微镜一样,SNOM和NSOM的应用仅限于表面研究。5

值得注意的是,通过使用荧光团、光物理学和/或光化学,可以获得上述所有显微技术中更高的图像分辨率。但是,即使是这些改进也无法与超分辨率显微镜相匹配。超分辨率显微镜将光学分辨率提高了近十倍。

 

 超分辨率荧光显微镜

超分辨率显微镜包括基于定制照明、单个荧光分子定位和非线性荧光团效应的技术,以锐化显微镜的点扩散函数(PSF)。PSF定义了显微镜的分辨率,在定点对象中,图像的三维强度分布称为“PSF”。

一般来说,超分辨率活细胞显微镜最具挑战性的部分是观察具有多维时间序列的动态过程,而不改变细胞的生理机能。随着超分辨率显微镜的商业化,细胞反应的新见解有望在不久的将来实现。我们提供的各种荧光探针将有助于使超分辨率显微镜的潜力得以实现。下面讨论其中一些超分辨率显微镜技术。

受激发射耗尽显微镜

STED显微镜背后的想法是生成直径小于衍射极限的照明光束。该技术使用传统的集中低强度激光束进行激发,以及第二个高强度红移环形光束,该光束耗尽了中心区域外荧光团的发射。第二个光束,被称为STED或耗尽光束,迅速使激发的荧光团分子回到振动基态。该方法仅允许来自衍射极限焦域的小中心部分的光发射。较小的PSF导致分辨率提高约10倍。增加耗尽光束的强度可以进一步提高分辨率,但也会造成生物样品的光损伤,因此必须谨慎使用。此外,重要的是要了解并非所有的荧光团都适用于STED。适合STED的荧光团应该在耗尽光束波长范围内具有发射功能,并且它应该具有光稳定性以承受耗尽波长处的高强度的能力。

STED显微镜已成功应用于生物样本。例如,它已被用于显示人神经母细胞瘤中的神经丝并创建神经元轴突中突触小泡的视频速率成像。开发了STED显微镜的Stefan Hell凭借他的成就获得了2014年诺贝尔化学奖。

可逆饱和光学线性荧光跃迁(RESOLFT)和基态耗尽(GSD)显微镜

分辨率GSD显微镜均可有效降低STED光束强度。RESOLFT使用可切换的荧光探针,同时具有开启和关闭状态。探针被环形光束关闭,只能在限定的聚焦体积内产生可检测的荧光探针。可切换探针的开/关闭状态为长寿命状态,因此关闭探针所需的光强度低于STED显微镜。GSD显微镜应用与RESOLFT相同的理论,但这里荧光团被送入亚稳态黑暗状态(例如三重态)。这些黑暗状态的寿命远远长于荧光寿命。因此,STED所需的光束强度要小得多。6-8值得注意的是,光漂白存在主要问题,因为在黑暗状态下荧光团的持续照射。GSD已被用于检查钻石中的氮空位中心。9

然而,探针的缓慢切换是RESOLFT和GSD生物样品中的一个问题,尽管在这方面正在取得进展。最近,光可切换荧光蛋白rsEGFP2被证明可以提高切换速度,并被用于观察内质网的动态。10尽管如此,这些技术在生物学研究中仍然不受欢迎。

饱和结构照明显微镜

SSIM可以被认为是与STED显微镜相反的。SSIM中的照明模式与SIM相似。然而,荧光激发被高激发强度饱和。这导致有效照明模式中的尖锐暗区,提供高分辨率空间信息。空间分辨率受荧光饱和度水平的限制。对于SSIM,荧光团必须具有较高的光稳定性,因为在大部分成像过程中荧光团都保持在高反应性激发态。11

单分子定位显微镜:光激活定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)

单分子显微镜是一种通过分子产生图像分子的技术,其基础是Eric Betzig和William Moerner的工作,他们都与Stefan Hell分享了2014年诺贝尔化学奖。该技术基于一个简单的原理,即使用微弱的激光脉冲,并在随后的成像周期中开启和关闭一组荧光分子。每个周期仅发射少量分子,就可以处理一系列图像,获得完整的高分辨率图像。生物样品可以通过确定每个荧光团分子一个接一个的定位,以纳米分辨率成像。PALMSTORM都是单分子定位的方法。PALM显微镜使用可光活化的荧光探针,STORM使用光可切换的化学荧光团(主要是在黑暗和光照状态之间循环的花青染料对)。直接STORMdSTORM是风暴的一种变体,使用在长寿命暗态(例如,三重态)和明态之间移动的单一荧光团来利用闪烁现象。STORM和PALM都需要可以控制其状态的探针。探头也必须明亮,两种状态之间应有较高的对比度。此外,这两种方法都可用于生物样品的研究。特别是,PALM已与量子点追踪相结合,观察脊柱形态的动态变化,多色STORM已被用于与网格蛋白包被的小孔一起成像微管。

 

 用于超分辨率显微镜的荧光探针

Abberior染料

Atto染料

 

 超分辨率显微镜中影响空间分辨率的因素11,16

标记密度

所有超分辨率显微镜方法中都存在标记密度的问题。一般来说,标签不足会导致伪影。另一方面,在单分子定位方法中,高标记不是有利的。这种差异是因为在黑暗状态下,大多数荧光团不会变暗,而是要么发出微弱的荧光,要么自发切换到荧光状态,尽管没有激活光。微弱的环境荧光会导致单分子图像的重叠。

时间分辨率

对于STED和RESOLFT显微镜,高的空间分辨率需要较小的扫描像素尺寸,因此采集速度较慢。为了获得更快的时间分辨率,通常的做法是缩小成像区域的面积并使用放大的像素尺寸。时间分辨率也可以通过使用多个激励焦点来提高。在单分子定位方法中,成像速度受到荧光团定位密度积累所需时间的限制。累积速率取决于荧光探针的切换动力学和相机的采集速率。关于STORM和PALM,不能通过减少图像面积来快速提高成像速度。

超分辨率探针

荧光探针的选择在超分辨率显微镜中至关重要。正如我们所说,每种技术对于最佳荧光探针都有不同的标准。光漂白的风险、荧光探针的状态和探针的亮度是选择超分辨率探针的一些重要因素。另外,使用多个标签的实验需要更多的考虑。我们提供针对超分辨率显微镜优化的荧光探针。

所有的超分辨率技术在空间分辨率、荧光探针、采集时间、图像处理等方面都有取舍。在决定使用哪种方法之前,需要考虑这些因素。表1简要概述了本文中讨论的不同显微镜技术。

 

表格 1:荧光显微镜12-15

 

类型 显微镜照明 分辨率(nm) 采集时间 后图像处理 问题
标准荧光显微镜 Epi*/TIRF/共聚焦 250 - - 有限分辨率
SSIM 宽场(epi/TIRF) 50 长(分钟) 光漂白作用
STED 激光扫描 30-70 短(s) 光漂白作用
RESOLFT 激光扫描 40-80 长(分钟) 中度光漂白
GSD/PALM/STORM 宽场(epi/TIRF) 10-55 长(分钟) 过度/不足标签伪影

*epi代表辐射荧光

 

 参考文献

  1. 谢尔梅勒,洛塔尔,雷纳海因茨曼和海因里希莱昂哈特。”超分辨率荧光显微镜指南。"细胞生物学杂志190.2(2010):165-175.
  2. 乌斯托内,A.和D.W.皮斯顿“多光子显微镜的简介。"显微镜杂志243.3(2011年):221-226.
  3. 奥利弗·冯·波伦。“细胞生物学需要超分辨率。”细胞生物学爱德华杂志2(2015):1-3.
  4. 谢尔梅勒,洛塔尔,等。”用三维结构照明显微镜对核周边进行亚衍射多色成像。"科学320.5881(2008):1332-1336.
  5. 德兰格,弗兰克,等。“超出衍射极限的细胞生物学:近场扫描光学显微镜。"细胞科学杂志114.23(2001):4153-4160.
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  8. 黄、博、哈森巴布科克、庄小威。“打破衍射障碍:细胞的超分辨率成像。" 细胞143.7(2010):1047-1058.
  9. 布拉德肖,拉尔夫A.,斯塔尔,菲利普D.“细胞生物学百科全书”。学术出版社(2015):81.
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  11. 加尔布雷斯,凯瑟琳G.和詹姆斯A.加尔布雷斯。“超分辨率显微镜一目了然。"J细胞科学124.10(2011):1607-1611.
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  16. 黄、博、马克·贝茨、庄小威。 “超分辨率荧光显微镜。" 生物化学年度评审78(2009):993.
     

有关STED显微镜的更多信息:
徕卡显微系统有限公司(PDF,0.9 MB)
Abberior仪器(PDF,3.1 MB)产品经理:

产品经理Monika Baeumle
作者:查维·阿加瓦尔


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