细胞生物学

β-分泌酶(BACE1)活性测定试剂盒:一种用于BACE1抑制剂筛选的荧光共振能量转移检测

Lisa Prostak, Efrat Barnea, Pnina Yaish and Dorit Zharhary

Sigma-Aldrich 公司

引言
近年来,阿尔茨海默症(AD)发病机制中涉及的生物学过程越来越被人们所了解。BACE1蛋白酶在此过程中发挥关键作用,它切割淀粉样蛋白前体蛋白(APP)产生淀粉样蛋白β42肽片段,最终形成淀粉样斑块。因此研发BACE1蛋白酶的特异性抑制剂是阿尔兹海默症药物研发最活跃的领域之一。本文介绍了一种用于鉴定和分析这类抑制剂的荧光共振能量转移筛选系统。

背景介绍
许多国家人口老龄化造成神经退行性疾病的患病率增加,寻找其治疗或治愈方法已成为全球研究人员关注的焦点。阿尔兹海默症是痴呆最常见的病因,随着年龄增加可能发病。联合国人口预测估算到2050年,80岁以上的人口数量将接近3.7亿。目前,85岁以上的人口约有50%患有阿尔兹海默症,并且这个数字超过全球人口50年内患上痴呆症1亿。需要持续治疗和相关医疗服务的广大人群将给医疗,金融和人力资源带来巨大负担。

阿尔兹海默症的发病是渐进的,临床症状出现在60-70岁之间,并且以认知功能的逐渐丧失为特征。 阿尔兹海默症病程的主要原因之一是淀粉样β肽(Aβ)在脑中的积累。 Aβ通过蛋白酶BACE1(β-分泌酶或β-位点APP-切割酶)和γ-分泌酶(图1)连续切割淀粉样蛋白前体蛋白而形成。 Aβ分泌到细胞外空间并积聚形成聚集体,原纤维和最终淀粉状蛋白沉积物,称为老年斑。由分泌酶切割形成的两种Aβ是Aβ40和Aβ42,后者是在老年斑的普遍形式。阻断BACE1或γ-分泌酶的活性可以抑制Aβ肽的产生。因此,鉴定阻断分泌酶活性的蛋白质或化合物一直是阿尔兹海默症研究的主要目标。

由于临床没有有效的治疗药物,因此研究γ-和β-分泌酶的抑制作用对阿尔兹海默症患者进行治疗性干预越来越成为研究热点[1-3]。敲除试验表明BACE1对于Aβ的产生至关重要。缺乏BACE1的转基因小鼠不产生Aβ,但表型正常且对活力或形态学无不利影响[4]。该试验显示出实现BACE1抑制而不产生毒副作用的可能性。因此,BACE1已成为药物研发的目标。


图1. 淀粉样前体蛋白的切割。淀粉状蛋白前体蛋白(APP)首先被β-分泌酶(BACE1)依次切割,然后被γ-分泌酶切割形成可溶性淀粉样前体蛋白β(sAppβ)和淀粉样蛋白β42肽片段(Aβ42)。然后Aβ42片段聚集形成阿尔茨海默氏病中常见的细胞外老年斑。

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特点和优势
Sigma-Aldrich BACE1活性测定试剂盒(货号CS0010专为BACE1抑制剂筛选设计,其基于便捷的荧光共振能量转移(FRET)方法,底物被BACE1切割后可观察到荧光信号(图2)。2小时内可得到结果,数据可在添加终止溶液后24小时内收集。



图2. 测定原理。底物一端与荧光染料连接,另一端与淬灭基团连接。分子内共振能量转移至淬灭基团引起底物的荧光显著降低。当底物被酶切割后,能量转移受到干扰导致荧光信号增强。

该试剂盒提供检测BACE1活性所需的所有试剂,其份量足以在96孔板中进行100微升抑制反应250次。试剂包括荧光分析缓冲液,终止溶液,底物,标准品和BACE1酶(β-分泌酶)。

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分析步骤
在缓冲液中制备BACE1底物浓度为50 µM。在相同的缓冲液中制备BACE1酶浓度约为0.3单位/微升。制备标准品溶液浓度为100 µM并添加至孔中,其最终浓度值为100 pmol,200 pmol,300 pmol和500 pmol。在DMSO或其他适当的溶剂中制备测试样品的原液,然后在缓冲液中连续稀释以得到期望的工作浓度。

然后将BACE1酶,底物,标准品,检测样品和缓冲液加入到孔中,总体积为100微升,最后在读数之前添加BACE1酶(表 1)。

设置荧光计激发波长320nm,发射波长405nm,添加BACE1酶后立即记录基线荧光。然后覆板于37℃孵育2小时。之后再次记录荧光。添加终止溶液可稳定信号长达24小时。

表 1. 每个分析的组分

样本 底物 荧光分析缓冲液 检测样本 标准品 BACE1 酶
阴性对照 20 µl 80 µl none none none
阳性对照 20 µl 78 µl none none 2 µl
检测样本 20 µl 78-X µl X µl none 2 µl
标准品 (100 pmol) 20 µl 79 µl none 1 µl none
标准品 (200 pmol) 20 µl 78 µl none 2 µl none
标准品 (300 pmol) 20 µl 77 µl none 3 µl none
标准品 (500 pmol) 20 µl 75 µl none 5 µl none

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计算和结果

37℃时BACE1酶在1-2小时内将5-20%的底物转化为荧光产物。所有信号读数减去阴性对照的荧光单位(FU)并将🇬🇧单位与标准浓度作图(图3)得到标准曲线。将测试样品的荧光单位从曲线中排除得到一个 pmol值,并用于下面的等式计算由样品切割的BACE1百分比:

 

切割 %  = 
S x 50
 500


其中S是样本的 pmol值,500是标准品最高 pmol值,经校准代表BACE1切割50%。


图 3. 标准曲线

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通过以对数标度绘制每个检测样本稀释液对初始浓度的切割百分比得到抑制曲线。示例曲线如图4。该曲线的绘制使用标准试剂盒分析方案中已知的他汀类药物 BACE1抑制剂[Asn670, Sta671, Val672] - 淀粉样蛋白β/ A4前体蛋白770片段[662-675],铵盐(货号A1847)。


图 4. 他汀类药物对BACE活性的抑制(货号 A1847)。37℃时将BACE1与各个浓度梯度的抑制剂孵育2小时。使用BACE1活性测定试剂盒(货号 CS0010)测定BACE1活性。

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BACE1分析试剂盒的其他用途

BACE1活性测定试剂盒也可用于测量组织匀浆中的BACE1活性。 图5 显示使用10微克/反应测量大鼠脑和肝组织匀浆中的BACE1活性。无论是否存在抑制剂(([Asn670,Sta671,Val672]  - 淀粉样蛋白β/ A4前体蛋白770片段[662-675]铵盐),均以10 µM的浓度测量活性。含有和不含抑制剂的样品测得的荧光(ΔFU)之间的差异显示出实际的BACE1活性。如 图5 所示,在大鼠脑中检测到BACE1活性,而在其肝脏中没有显著活性。



图 5. 大鼠肝脏和脑匀浆中的BACE1活性。根据BACE1活性测定试剂盒(货号 CS0010)检测大鼠脑和肝匀浆中的BACE1活性。结果显示为Δ荧光单位(ΔFU),即在不含抑制剂的样品中检测到的荧光减去含有抑制剂 ([Asn670, Sta671, Val672]-淀粉样蛋白β/ A4前体蛋白770片段[ 662-675]铵盐,货号 A1847)样品的荧光。记录荧光4小时。该Δ表示由BACE1活性特异性测得的净荧光。

 

总之, Sigma-Aldrich BACE1活性测定试剂盒是测定BACE1酶活性的实用工具。更重要的是,该试剂盒可帮助研究人员鉴定在阿尔兹海默症发病机制中关键的BACE1蛋白酶的抑制剂。

 

参考文献

  1. Citron, M., Beta-secretase as a target for the treatment of Alzheimer's disease., J. Neurosci. Res., 70, 373-379 (2002).
  2. Hong, L., et al., Memapsin 2 (beta secretase) as a therapeutic target., Biochem. Soc. Trans., 30, 530-534 (2002).
  3. Rochette, M.J., and Murphy, M.P., Gamma secretase: substrates and inhibitors., Mol. Neurobiol., 26, 81-95 (2002).
  4. Roberds, S.L., et al., BACE knockout mice are healthy despite lacking the primary beta-secretase activity in brain: implications for Alzheimer's disease therapeutics., Hum. Mol. Genet., 10, 1317- 1324 (2001).

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