多肽和蛋白质

多肽的溶解指南

不恰当的溶解可能会导致多肽/蛋白损失和实验失败。如果信息可用,可在产品信息页或分析证书中找到溶解信息。如果溶解度信息未知,则选用的多肽或蛋白质溶解溶剂在使用前至少应满足三个条件:

  1. 所选溶剂能够高效溶解蛋白质。
  2. 溶剂务必适用于实验应用。
  3. 溶剂不会与蛋白质发生反应或促进蛋白质降解。

另一种明智的方法是在溶解所有样品之前,先测试一小部分样品的溶解度,并选择一种能够通过冻干法而轻松去除的初始溶剂,从而可从溶剂中回收多肽/蛋白质。

确定溶解特性
在向冻干多肽中添加任何溶剂之前,应先评估多肽的氨基酸组成,以便初步了解多肽的溶解特性。多肽中离子电荷的数量和类型决定了其在水溶液中的溶解度。通常,多肽的带电残基越多,其在水溶液中的溶解性越高。此外,多肽在pH 6–8环境中比在pH 2–6环境中具有更多电荷。因此,多肽在近中性pH条件下的溶解度更高。 许多例外情况发生于疏水性很强和易于聚集的多肽序列中。尽管序列具有疏水性是发生聚集的主要原因,但多肽也可通过广泛的氢键网络而发生聚集或“胶凝”。 以下指南可用于确定多肽是碱性、酸性还是中性。

  1. 将每个酸性残基(D、E和C末端COOH)赋值为-1。
  2. 将每个碱性残基(K、R和N末端NH2)赋值为+1。
  3. 将pH<6条件下的每个H残基赋值为+1,pH >6条件下为0。
  4. 计算pH 7条件下多肽带电荷总数(所有D、E、K、R、C末端COOH和C末端NH2)。
  5. 计算多肽的净电荷总数。

带电多肽的溶解方法
基于上述指南,可使用以下方法进一步测试多肽的溶解度:

  1. 如果多肽的净电荷总数为负值,则认为多肽是酸性的。如果多肽是酸性的,和/或如果多肽在pH 7环境中的带电荷总数大于残基总数的25%,则添加少量0.1M碳酸氢铵溶解多肽,并用水将其稀释至所需浓度。应确保所得多肽溶液的pH值大于7,可根据需要调整pH。
  2. 如果多肽的净电荷总数为正值,则认为多肽是碱性的。如果多肽是碱性的且多肽在pH 7环境中的带电荷总数是残基总数的10–25%,则添加少量的25%乙酸溶解多肽,并用水将其稀释至所需浓度。
  3. 如果多肽的净电荷总数为0,则认为多肽是中性的。如果多肽的带电荷总数大于残基总数的25%,则使用第1部分所述的溶解方法。如果多肽的带电荷总数是残基总数的10–25%,则使用有机溶剂(见下文)。
  4. 如果多肽的带电荷总数低于残基总数的10%,建议使用有机溶剂。

注意:多肽务必完全溶解于初始溶剂(如乙酸、乙腈、DMSO或DMF),因为多肽溶于这些溶剂的速率通常高于水/溶剂混合液。如果首先使用水/溶剂混合液溶解多肽,则您可能最后需要向多肽样品中添加远远大于需求量的非水性溶剂。

对于任何使用的溶剂,初始溶剂的最大浓度将取决于测定对所用溶剂的耐量。在尝试使用更强的溶剂之前,有必要对多肽溶液进行超声处理,以确定多肽不溶于当前所用溶剂。超声可促进溶解,从而将固体多肽分解成小颗粒。如果溶液在超声后形成胶体、呈混浊状态或含有可见微粒,则表示多肽未完全溶解,而是处于悬浮状态。在这种情况下,需要使用更强的溶剂。如果多肽未溶解,则冻干去除挥发性缓冲液。一旦样品干燥,即可在相同样品上试用其他溶剂。

当多肽溶解于初始溶剂后,特别是溶于有机溶剂后,通过将多肽溶液缓慢添加(逐滴)至缓冲液中,同时持续轻轻搅拌,以对多肽进行稀释。这样可防止多肽在水溶液中局部集中,进而导致多肽形成沉淀。这种加液方式的优势在于能够直观监测沉淀形成的可能性并采取相应的措施。

疏水性/不带电多肽的溶解方法
上述建议方法基于多肽的带电性质,可能无法充分溶解序列中含有50%以上疏水性残基的多肽、带电荷量低于25%的中性多肽和/或带电荷量低于10%的多肽。在这些条件下,建议使用有机溶剂,如乙腈(ACN)、二甲亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)。

注意:含有Cys(C)和Met(M)的多肽序列在DMSO中不稳定。

加入离液序列高的化合物,如盐酸胍或尿素,有助于通过干扰氢键网络而破坏多肽的疏水性相互作用或减少多肽的“胶凝”。此外,初始有机溶剂或离液剂的浓度取决于检测系统对溶剂的耐量。

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