L-半胱氨酸和L-胱氨酸在细胞培养中的应用

半胱氨酸在无血清真核生物细胞培养中的重要性和用途,包括杂交瘤和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞

L-半胱氨酸和L-胱氨酸,无血清培养基添加剂,在生物生产中有功用;组织工程和特殊培养基

L-半胱氨酸和/或其氧化产物L-胱氨酸是细胞培养必需氨基酸。在体外L-半胱氨酸氧化为L-胱氨酸相对容易。细胞培养基的性能和稳定性受到各种形式的L-半胱氨酸以及L-半胱氨酸等价物的存在以及比例的影响。L-半胱氨酸和L-胱氨酸进入细胞要通过不同的转运蛋白,其控制着特定细胞利用不同形式L-半胱氨酸的能力。几乎所有的经典和无血清培养基都含有某种形式的L-半胱氨酸。它可以作为L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、L-半胱氨酸混合二硫化物或者各种肽的形式添加。除了它在蛋白质合成中的作用外,L-半胱氨酸还是三肽谷胱甘肽的功能活性。它对谷胱甘肽合成的作用是限速。

以下培养基配方中都含有L-半胱氨酸:Fitton-Jackson改良版BGJb培养基、Coon改良版F-12培养基、L-15培养基、McCoy 5A改良培养基、MCDB培养基、Ham F-10营养混合物、Ham F-12营养混合物、Kaighn改良版Ham F-12营养混合物(F12K)、无血清/不含蛋白质的杂交瘤培养基和各种特殊培养基。当这些培养基储存为液体时,L-半胱氨酸转化为L-胱氨酸。在极端条件下,L-胱氨酸被进一步氧化。

直接添加L-胱氨酸的培养基:Ames培养基、Eagle基础培养基(BME)、Click培养基、CMRL-1066培养基、杜氏改良Eagle培养基(DMEM)、Fischer培养基、Glascow改良Eagle培养基(GMEM)、Iscove改良 Eagle培养基(IMEM)、 最低必需Eagle培养基(EMEM)、RPMI-1640和各种特殊培养基。

以下培养基的L-半胱氨酸和L-胱氨酸配制比例不同:DMEM / Ham营养混合物F-12(50:50)、H-Y培养基(Hybri-Max®)、培养基199、NCTC培养基、Waymouth 培养基MB、Williams培养基E以及各种特殊培养基中。用于生物生产和组织工程的专用培养基通常含有额外添加的L-半胱氨酸等价物,例如N-乙酰半胱氨酸。

添加L-半胱氨酸和L-半胱氨酸等价物的培养基用于真核细胞的无血清培养,是因为L-半胱氨酸和L-胱氨酸的R链含有硫原子,可参与硫氧化、还原、自由基以及金属配位化学过程。因此,在细胞培养中有效的使用L-半胱氨酸和L-半胱氨酸等价物需要了解其在其他培养基组分中的化学性质。

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L-半胱氨酸和L-胱氨酸在细胞培养系统中的主要功能

从营养学上来说,胱氨酸和半胱氨酸被认为是非必需氨基酸,因为它们可在哺乳动物的肝脏中合成。但是,对于细胞培养而言,它们是必须从外源提供的必需氨基酸。这两个氨基酸可非酶相互转换且不稳定,它们的有效的补充也因此变得复杂。了解它们的化学性质以及被细胞利用的方式是成功设计培养基的关键因素。

  • 半胱氨酸和胱氨酸都以蛋白质中的氨基酸残基形式存在。蛋白胱氨酸残基通过掺入之后氧化半胱氨酸硫氢基形成。蛋白质内和蛋白质间二硫键的形成和破坏在二级和三级结构的决定中起着重要作用。
  • 半胱氨酸具有非常重要的保护细胞免受氧化应激的间接作用。它是用于合成三肽谷胱甘肽的限速氨基酸。谷胱甘肽具有将脱氢抗坏血酸氧化成抗坏血酸的能力,而抗坏血酸是参与阻止脂质过氧化的主要水性抗氧化剂。它也是硒蛋白抗氧化酶的底物。在缺乏L-半胱氨酸或半胱氨酸等价物的情况下,谷胱甘肽迅速耗尽,细胞也将死亡。
  • 许多细胞代谢半胱氨酸后形成亚牛磺酸和牛磺酸。这两种分子分别通过与羟基自由基和次氯酸反应来帮助细胞培养基解毒。牛磺酸还可以保护氧化损伤的细胞免受由钙离子通量引起的死亡。
  • 未配对的蛋白半胱氨酸硫氢基可以与游离的半胱氨酸硫氢基反应形成混合的二硫化物。这些二硫化物可作为半胱氨酸等价物的储存和运输库存。白蛋白含有一个非配对的半胱氨酸硫氢基,可与非蛋白半胱氨酸的硫氢基形成二硫键。通过这种方式,白蛋白可以结合并阻止半胱氨酸在培养基中的其他反应。蛋白质结合的半胱氨酸硫氢基还可以与其他硫氢基分子如谷胱甘肽反应,并导致形成混合的二硫化物。

胱氨酸和半胱氨酸在细胞培养中的一些可能用途包括蛋白质合成,自氧化,与蛋白质混合成二硫化物,谷胱甘肽的合成和辅酶A的合成。

L-半胱氨酸和L-胱氨酸的化学属性使其成为有用的无血清培养基添加剂

半胱氨酸的经验式为C3H7O2NS,分子量为121.16。胱氨酸的经验式为C6H12O4N2S2,分子量为240.31。它由两个二硫键连接的半胱氨酸分子组成。胱氨酸和半胱氨酸是可互换的含硫氨基酸。与这些氨基酸结合的硫原子为氧化还原活性和电子转移提供位点。硫原子可以作为自由基存在。

在体外,半胱氨酸易溶且最初以中性氨基酸存在。它不稳定,可进行非酶促的自动氧化。铁和/或铜阳离子可加速其自氧化。所得到的还原阳离子与剩余的半胱氨酸络合(例如半胱氨酸:亚铁络合物)并催化过氧化氢转化成羟基自由基和硫化物自由基。

半胱氨酸和胱氨酸自由基化学

过渡金属铜和铁大大的增加了半胱氨酸的氧化。半胱氨酸的单价氧化产生了它的硫自由基。半胱氨酸的硫自由基可参与双分子氧、半胱氨酸、另一个半胱氨酸硫基或其他自由基的反应。与氧或半胱氨酸反应产生其他的自由基并扩散氧化过程。与另一个硫基自由基反应终止自由基的扩散。与另一个半胱氨酸硫自由基反应会形成胱氨酸。胱氨酸易于进一步氧化成磺基丙氨酸和其他氧化产物。胱氨酸自由基可以与过氧化氢反应形成羟自由基。半胱氨酸和胱氨酸自由基的氧化反应不限于上述那些。

铜可能影响半胱氨酸和胱氨酸的溶解度。亚铜可形成半胱氨酸的亚铜硫醇盐,二价铜可与胱氨酸螯合。这两种形式都不溶。亚铜也可能将胱氨酸还原为半胱氨酸。

上述反应可以

  • 使胱氨酸和半胱氨酸不能为细胞所使用
  • 使细胞培养基产生毒性
  • 改变液体培养基中半胱氨酸和胱氨酸的比例和量。这很重要,因为细胞类型不同摄取半胱氨酸和胱氨酸的能力也不同。

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