L-谷氨酰胺在细胞培养中的应用

谷氨酰胺在无血清真核细胞培养,包括杂交瘤细胞和中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)中的应用和重要性

   

谷氨酰胺是一种无血清培养基添加剂,在生物制造,组织工程和特殊培养基中都非常有用:

L-谷氨酰胺是细胞培养基配方中需要的一种不稳定的基本氨基酸。大多数商业化的无L-谷氨酰胺培养基配方不是在基础培养基配方中包含了L-谷酰胺,就是需要在使用时在液体培养基里添加。L-谷氨酰胺在液体培养基生理pH条件下不稳定。它分解成氨和焦谷氨酸的速度对于许多生物制造应用来说都是问题。如今,几种生物制造领域专门的培养基添加的是二肽形式的L-谷氨酰胺,比如丙氨酰L-谷氨酰胺和甘氨酰L-谷氨酰胺。另一种还有待进一步研究的L-谷氨酰胺来源是蛋白质水解产物,尤其是麸质水解产物。

经典培养基中L-谷氨酰胺浓度从Ames培养基的0.5 mM到MCDB 培养基131的10 mM 不等。生物制造和组织工程应用中用到的浓度通常为 2 到4 mM。DMEM/Ham营养混合物(50:50)经常作为中国仓鼠卵巢细胞CHO专门培养基的参考配方。 DMEM/F12 营养混合物中的L-谷氨酰胺浓度为 2.5 mM。L-谷氨酰胺在无血清/无蛋白杂交瘤细胞培养基中的浓度是2.7 mM。在DMEM, GMEM, IMDM 和H-Y培养基中的浓度是4 mM。IMDM经常作为杂交瘤细胞专门培养基的参考配方。在L-谷氨酰胺浓度高于培养基建议平均浓度条件下,杂交瘤细胞长得更好。

鉴于L-谷氨酰胺的化学不稳定性和它对细胞生长和功能的重要性,有针对性地根据不同细胞的培养过程优化L-谷氨酰胺添加就显得尤为关键。细胞培养中L-谷氨酰胺和L-谷氨酰胺等价物的有效使用,需要对其化学性质和各种形式有较深理解。想要了解更完整的关于L-谷氨酰胺作为细胞培养添加剂的讨论,请前往Sigma Media Expert页面。

   

谷氨酰胺在细胞培养系统中的首要功能

谷氨酰胺能支持有较高能需,并且合成大量蛋白及核酸的细胞的成长。它可以作为细胞快速分裂和无法有效使用葡萄糖类细胞的另一种能量来源。细胞需要氮原子来构建一些分子,比如核苷酸,氨基酸,氨基糖和维生素。铵是氮的一种无机来源,在生理pH值下主要以带正电阳离子 NH4+的形式存在。细胞所用的铵氮首先被加入到有机氮中,成为谷氨酸中的胺或谷氨酰胺中的酰胺。这两种氨基酸则可以作为蛋白质,核酸和其他含氮化合物合成的主要氮源库。

生成谷氨酸和谷氨酰胺的固氮反应需要消耗能量等价物。谷氨酸是由铵和α-酮戊二酸,一种三羧酸循环(TCA)中间物合成。它的合成需要氧化 NADH 或NADPH。谷氨酰胺是由氨和谷氨酸合成,合成需要消耗ATP。谷氨酸合成所需要的酶,谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.4)和谷氨酸合成酶(EC 1.4.1.13)是可逆的。谷氨酰胺合成所需要的酶,谷氨酰胺合成酶 (EC 6.3.1.2),受到高度调控以控制谷氨酰胺的产出量,符合细胞需求。谷氨酰胺分解生成谷氨酸和氨的过程需要线粒体酶,谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2 )。体内产生的铵能通过尿素代谢。在体外,铵无法通过尿素代谢。在某些体外条件下,氨在细胞外培养基中以铵离子的形式累积。

   

谷氨酰胺的作用

  • 谷氨酰胺中酰胺和胺各含有一个氮原子,能大量将氮元素运送到细胞内。而携带等量的氮的自由铵则是有毒的。
  • 谷氨酰胺中酰胺氮被用于维生素NAP和NADP,嘌呤核苷酸,UPT转CTP和天冬酰胺酸的合成。谷氨酰胺中的氮还可以用来生产嘧啶合成所需要的氨甲酰磷酸。
  • 谷氨酰胺是谷氨酸前体。谷氨酸是作用于α-酮酸转氨形成其他α氨基酸的关键氨基酸。
  • 当葡萄糖含量低而能量需求高时,细胞能分解氨基酸获得能量。谷氨酰胺是最易使用的可以作为能量来源的氨基酸之一。它也是许多体外细胞快速分裂的主要能量来源。

   

谷氨酰胺的化学特性使它成为无血清培养基中非常有用的添加剂

 

谷氨酰胺

分子式: C5H10N2O3

分子量:146.15

等电点(pH): 5.65

Pka = 2.17 和9.13

 

谷氨酰胺稳定性:

L-谷氨酰胺是一种含R基团酰胺,能够自由溶解的中性氨基酸。在液体培养基中,不需要酶就能够分解成氨和焦谷氨酸(吡咯烷酮羧酸)。L-谷氨酰胺随时间分解程度取决于培养基的pH,温度和各种阴离子。谷氨酰胺去氨基化在酸性和碱性条件下都会发生,并且在磷酸盐和重碳酸盐存在条件下发生更快。磷酸盐浓度固定时,当pH值从4.3 升到10时,去氨速率变快。在有磷酸盐的情况下,当pH值从7升到8时,去氨速率的增加与pH值增加的速率几乎成线性关系。

当谷氨酰胺作为蛋白质或者肽类的氨基酸残基时,它是稳定的。谷氨酰胺可以以二肽和蛋白质水解物的形式提供给细胞培养。麦麸是肽基谷氨酰胺的丰富来源,已经被成功应用于无血清,无动物蛋白的中国仓鼠卵巢重组细胞 (rCHO) 培养基。

 

谷氨酰胺产品促进无血清培养中杂交瘤细胞,中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和其他哺乳动物真核细胞生长。

 

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