活细胞研究和分析工具

PCR、抗体IHC染色等细胞分析方法由于只能反映某个时间点的细胞行为而具有局限性。当传统细胞分析方法无法获得预期结果时,使用实时细胞分析方法通常会得到很多新的生物学发现,因此活细胞分析技术在科研过程中发挥着越来越关键的作用。为了研究单个细胞的行为、生长和分化、细胞间互作等,可以在不影响细胞形态和功能的前提下永久标记细胞群体是至关重要的。本司提供多种新型荧光细胞标记技术用于细胞示踪、荧光慢病毒生物感应器、荧光染料和探针进行实时细胞分析。

 

 活细胞成像/细胞追踪试剂

荧光细胞追踪染料,结合流式和图像细胞计数是非常强大的工具,可用于体内和体外研究不同细胞类型的互作和命运。尽管有成千上万已发表文献在使用这些染料,但使用最广泛的细胞示踪应用包括监控:1)干细胞和祖细胞静止、增殖和/或分化;2)抗原驱动的膜传递和/或前体细胞增殖;3)免疫调控和效应细胞功能。

商品化的细胞追踪染料因其化学和荧光性质不同具有非常广泛的类型,但绝大多数可基于细胞标记机理分为两类:“膜染料”(典型代表:PKH26)是高度亲脂性的染料,稳定但非共价地插入细胞膜;“蛋白染料”(典型代表:CFSE)是氨基酸反应性染料,与细胞蛋白形成稳定的共价键。

细胞追踪试剂特性比较
 

理想特性 脂类嵌入剂 共价蛋白标签 遗传标记 放射标记
PKH Dyes Dil, DiO CFSE Biotin-SE GFP,β-Gal 111In, 51Cr
快速、简单标记 +++ 不定 +++ ++ - +
强列标记 ++++ 不定 ++++ ++++ 不定 +
均一和可重复 +++ 不定 +++ +++ + +
适用大多数细胞类型 ++++ 不定 +++ +++ 不定 不定
无免疫原性 ++++ ++++ + + ++ ++++
不影响细胞受体和功能 ++++ ++ 不定 不定 + -
稳定超过许多代 ++ + ++ + +++ -
直接增殖监测可能 ++++ ++++ 24-48hr延迟 24-48hr延迟 - 不定
易于监测体内分布 + + + + +/- +++

缩略词: Dil = 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; DiO = 3,3’-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate; CFSE = carboxyfluorescein succinimidyl ester; Biotin-SE = biotin-succinimidyl ester; GFP = green fluorescent protein; b-Gal = b-galactosidase


 PKH/CellVue®活细胞标记试剂盒

技术原理

PKH和CellVue® Fluorescent Cell Linker Kits荧光细胞标记试剂盒可为活细胞提供长久的荧光标记,且无明显的毒副作用。该试剂盒采用专利的创新细胞标记技术,强烈的荧光染料附着在长的亲脂性尾上,在短期的常规膜染色过程中(1-5分钟),亲脂性尾扩散入细胞膜,荧光部分暴露在细胞的外表面附近。由于该标记技术不具有特异性,因此可广泛应用于多种细胞类型,包括动物细胞、植物细胞以及其他含粒子的膜。

技术特点

  • 活细胞标记:标记细胞膜,可在体内和体外对标记细胞进行实时观察和跟踪
  • 无毒副作用:标记物质对细胞无毒性,不影响细胞的形态、生理进程、增殖活力
  • 荧光稳定持久:荧光强烈易操作,无明显染料渗漏或细胞间转移,荧光染料在体内活细胞上的半衰期长达100天
  • 数据稳定:细胞标记统一、数据可重复性强
  • 应用广泛:可标记真核细胞和细胞系、细菌和寄生生物,不同染料可实现多色分析,且与其他荧光标记兼容
  • 久经验证:经过多种细胞类型和应用验证,已发表文献近万篇

本司目前可提供3种颜色标记,其中PKH67是激发(490 nm)和发射(504 nm)波长类似于荧光素的绿色荧光,体内半衰期10-12天;PKH26是红色荧光,其激发(551 nm)和发射(567 nm)波长特征与丹明或藻红蛋白检测体系相容,同时也能被氩离子激光器发射的488 nm波长激发。PKH26在体内的半衰期超过100天,是理想的进行细胞增殖研究和其他长期实验的体内细胞追踪试剂。CellVue® Claret是一种在生理学范围不受pH影响的远红外荧光染料,其激发(655 nm)和发射(675 nm)波长特征与红光半导体激光器相容。该等交联剂生理学稳定,对细胞体系几乎无毒副作用。标记的细胞仍可保持生物学特性和增殖活性,是细胞示踪和细胞间相互作用研究的理想选择。

PKH/CellVue®染料标记细胞的标准流程

 

技术应用:

由于标记染料不具有特异性,PKH/CellVue®活细胞标记技术可用于多种类型的细胞和生物,目前已成功应用的细胞和生物类型,以及体内和体内应用如下:

 

 

应用举例

共聚焦检测单核细胞来源的巨噬细胞对恶性淋巴细胞的吞噬作用。巨噬细胞(FITC标记为绿色)、恶性淋巴细胞(PKH26标记为红色)和双特异性抗体在37°C孵育30、60和360分钟后检测,图像显示目标结合、摄入和破坏的过程。

L929细胞中PKH67的内化动力学(Dr. Xavier Rono提供)

PKH26标记的年轻迁移神经元侵入发育的皮层

共聚焦图片:PKH26标记的杜氏利什曼虫显示膜表面和鞭毛储存室(红色),核内表达GFP(绿色)。

位于鞭毛基部的高度标记的鞭毛储存室是一个仅由细胞膜组成的三维结构,是这些寄生原生动物体内的胞吞和胞吐作用的位点。(图片由Dr. E. Ghedin提供)

CellVue® Claret和DAPI双重标记U937细胞。对数增长的U937细胞被标记上CellVue Claret后在37°C培养24小时。37°C孵育过程中的膜转运使内膜和质膜都进行了标记,但与CFSE不同,CellVue Claret标记不渗透核被膜。

 

 LuminiCell Tracker™荧光纳米粒子

技术原理

LuminiCell Tracker™荧光纳米粒子与传统的染料不同,不存在浓度或聚合引起的淬灭(ACQ),

可用于在体内和体外进行增强效果的肿瘤和干细胞长期观察和追踪。

LuminiCell Tracker™具有新型染料AIE(aggregation-induced emission)特性的优势。新型AIE细胞追踪染料被封装在细胞可渗透的生物兼容应该纳米粒子内(AIE Dot),可提供超量的荧光(10x)、增强的光稳定性(3x)和低细胞毒性,适用于较长时间的生物成像应用。

技术特点:

  • 荧光更强:是其他细胞标记技术的10倍
  • 光稳定性:荧光信号不淬灭的时间延长3倍
  • 生物兼容:无毒性有机纳米粒子适合生物学应用
  • 快速标记:4小时内轻松完成细胞标记

LuminiCell Tracker™荧光纳米粒子的物理特性。A 装配LuminiCell Tracker™纳米粒子包括:附着细胞渗透TAT序列的荧光TPETPAFN AIE分子封装入DSPE-PEG200外壳内:1)自组装, 2)生物偶联。B. LuminiCell Tracker™纳米粒子和商业化Qtracker®的物理稳定性比较(37°C , 1xPBS中孵育0-9天)

 

使用LuminiCell Tracker纳米粒子进行活细胞成像。与传统的量子点技术相比,LuminiCell Tracker对细胞是无毒的,并能产生更亮的荧光信号。Hela细胞培养过夜,第二天加入4mM  LuminiCell Tracker™ 670或Qtracker® 655孵育4小时,然后在Day 1成像

血管标记实验。使用LuminiCell Tracker™-540血管标记试剂盒对小鼠大脑和耳朵进行体内荧光血管成像。该试剂盒包括不含TAT序列的绿色荧光AIE Dot纳米粒子,可在活组织和动物体内荧光标记血管研究炎症和血管渗漏。

使用LuminiCell Tracker进行体外肿瘤细胞追踪。HeLa细胞与4nM LuminiCell Tracker™-540孵育4小时弃掉孵育溶液,细胞再培养几天检测检测。LuminiCell Tracker™-540具有非常高的标记效率,D1标记将近100%,D5依然维持90%以上。D10依然可以观察到来自标记细胞的明显荧光。

使用LuminiCell Tracker进行体内肿瘤细胞追踪。A) 使用LuminiCell Tracker™-670标记试剂盒对MCF-7肿瘤细胞进行体内追踪。B) 标记后的MCF-7细胞立即皮下注射小鼠。C) 追踪至21天内,肿瘤位点的集成荧光强度

使用LuminiCell Tracker进行体内干细胞追踪。AIE dots标记可在体外对脂肪间充质干细胞进行长期追踪

使用LuminiCell Tracker进行体内干细胞追踪。

A) ADSCs的体内长时间追踪。

B) 含LuminiCell Tracker™ 670标记ADSC基质胶处理30天的小鼠缺血性后肢切片。

C) 含LuminiCell Tracker™ 670标记ADSC基质胶处理42天的小鼠缺血性后肢切片进行CD31染色

 

 

 LentiBrite™ Fluorescent Biosensors

LentiBrite™荧光慢病毒生物传感器是一套新的预包装慢病毒粒子,编码自噬、凋亡、和细胞结构的重要和基本蛋白质,使不同细胞/病情状态的活细胞和体内分析可视化。

特点和优势

  • 预包装,即用型、具有单体GFP&RFP荧光标签
  • 每管最低浓度测定(≥3 x 108 IFU/mL)
  • 与传统基于化学和其他基于非病毒的方法相比,具有更高的转染效率
  • 可转染分化、未分化和难转染细胞类型,比如原代细胞或干细胞
  • 不干扰细胞功能
  • 经过荧光显微镜和活细胞分析验证

应用举例:

对细胞骨架结构蛋白进行荧光活细胞成像

在过去15年,荧光蛋白(GFP/RFP)基因编码融合技术的发展和改进已彻底改变了亚细胞结构动力学的细胞分析。微管是由微管蛋白和肌动蛋白亚基组成的动态细胞骨架纤维,在有丝分裂(有丝分裂纺锤体)和间期时作为骨架引导驱动蛋白和动力蛋白介导的细胞物质移动。

利用LentiBrite™慢病毒生物传感器可视化微管(α-tubulin)、肌动蛋白微丝(β-actin)、微丝交联位点(α-actinin)、中间丝(vimentin)和粘着斑(paxillin),结果表明这些生物传感器可用于固定和活细胞荧光显微镜技术,且不会影响结构。GFP或RFP标记的蛋白定位于免疫组化方法鉴定的内源蛋白一致,生物传感器在使用已知的细胞骨架结构调节子处理时表现出特征重组。

LentiBrite™慢病毒生物传感器提供了对细胞骨架结构进行可视化和研究不同生理和病理处理条件下的动力学的便捷方法,且适合终点和实时活细胞成像模式。

因此,这个小组的慢病毒生物传感器提供了一个方便的方法来可视化细胞骨架结构和动力学在多种生理和病理的治疗条件下,在两个端点和实时活细胞成像模式。

质粒和慢病毒转染易转和难转细胞类型的结果比较。使用质粒DNA和脂质体化学转染试剂或LentiBrite™慢病毒粒子将TagGFP2-tubulin编码结构转染HeLa细胞和HUVECs。

慢病毒转染细胞中β-actin的活细胞延时成像。TagRFP-β-actin慢病毒传感器转染REF-52细胞,使用油浸宽视野显微镜实时成像。2μM细胞松弛素D处理细胞后立即成像,静帧捕获显示了精细丝状组织向细胞核附近的粒状结构的转变,以及细胞外围的弥散分布。

LC3介导自噬的荧光活细胞成像

自噬是一种降解通路,可为胁迫下的细胞提供回收利用的营养,在许多疾病包括癌症、神经衰弱和感染中扮演着保护和有害的双重角色。LC3家族的成员在自噬中央细胞器自噬体的成熟过程中发挥着关键作用。LC3前体弥散分布于胞质,通过蛋白水解形成LC3-I。自噬起始后,C末端甘氨酸被加上磷脂酰乙醇胺修饰形成LC3-II,然后迅速易位到新生的自噬体呈现点状分布。编码荧光蛋白融合LC3的DNA结构被广泛用于引入细胞,使用荧光显微镜监测细胞自噬体形成。

利用LentiBrite™慢病毒生物传感器可视化自噬,TagGFP2和TagRFP的C末端融合在自噬体标标志物LC3上。 LentiBrite™ GFP-LC3, GFP-LC3对照突变体和RFP-LC3慢病毒粒子提供明亮荧光和LC3在自噬体的精确定位,使难转细胞里自噬的活细胞分析成为可能。

自噬抑制剂3-MA阻止GFP-LC3的易位。TagGFP2-LC3 野生型 (GFP-LC3 wt)或TagGFP2-LC3G120A (GFP-LC3 突变体)通过慢病毒转导HT-1080细胞,转导的细胞在生长培养基培养或在含溶酶体抑制剂的EBSS中饥饿处理(+/-3-MA)。转导GFP-LC3 wt的细胞在3-MA存在时饥饿处理不再呈现胞质点状分布;转导负对照GFP-LC3突变体的细胞在任何环境下均维持分散的核质分布。

慢病毒转导使难转染原代细胞的自噬分析成为可能。

TagGFP2-LC3或TagRFP-LC3慢病毒转导HUVEC和huMSCs细胞,分别饲养和饥饿处理。

转导的荧光蛋白在生长培养基中呈现弥散分布,饥饿诱导的自噬发生后呈现点状分步。

 活细胞成像培养基

活细胞相关的实验操作如荧光显微镜、光遗传学和FACS等通常需要高水平或持续的暴露在蓝色光下,使有些培养基组分或添加剂会转化成有毒的自由基,尤其是DMEM、Neurobasal培养基、B-27、SATO和NS21等,从而导致细胞行为的显著变化和增加细胞死亡。有些培养基中甚至含有大量的荧光物质,会严重降低信噪比。

 BrightCell™ 光稳定细胞培养基

我们新推出的BrightCell系列光稳定培养基系统通过去除或替换光毒性组分可以延长细胞暴露在蓝色光下的时间,维持较高的细胞活性和功能性。另外,该系列培养基具有极低的自发荧光和或光漂白,可大幅度提高使用荧光活细胞成像获得的数据质量。

  • BrightCell™ MEMO®光稳定培养基可在蓝色光照射之前或过程中替代DMEM
  • BrightCell™ NEUMO®光稳定培养基专为神经细胞培养开发,可在活细胞成像实验中替代Neurobasal®培养基
  • BrightCell™ SOS®神经培养补充物可在活细胞成像实验中直接替代无血清光毒性替代物如B-27、NS21、SATO和N2等

应用举例

少突胶质前体细胞OPCs(A,B)、皮质神经元(C)和海马神经元(D)的增强的活细胞荧光成像。分别使用BrightCell™光稳定培养基(MEMO/SOS和NEUMO/SOS)和标准培养基(DMEM/SATO和Neurobasal/B27)培养这些细胞,然后进行呈现。结果表明与传统培养基相比,使用光稳定培养基培养的NG2+ OPCs、皮质神经元和海马神经元延长蓝光暴露时细胞活力较高。

胶质细胞的荧光细胞分选。与Neurobasal® 和 B27®相比,只有使用BrightCell™光稳定培养基NEUMO和SOS将MBP+ GFP/RFP标记的少突胶质前体细胞(OPCs)成功的进行FACs分选、培养和从成年小鼠大脑中分化。

神经元和星形胶质细胞的荧光活细胞成像。7天大的原代大鼠神经元细胞和星形胶质细胞在标准培养基(Neurobasal/B27)或BrightCell™培养基(NEUMO/SOS)进行暗或光培养。暴露在蓝光后对细胞进行神经元标志物Tuj1、GFAP和DAPI染色,结果表明标准培养基中的神经元和星形胶质细胞经过延长荧光暴露后出现普遍的细胞死亡,而BrightCell™培养基中的神经元细胞未出现细胞活力下降。

BrightCell™培养基中(NEUMO/SOS)神经元的活细胞荧光成像。A) 表达mApple (EGFP)和突变基因Matrin3 (YFP)的原代啮齿动物皮层神经元 B) 表达mApple (红色)和突变基因C9orf72 (黄色)的活体原代啮齿动物皮层神经元,使用核染料cyan染色。所有细胞均在BrightCell™ NEUMO/SOS培养基中生长。

BrightCell™培养基保护OPCs和人类神经干细胞的正常功能。A) 对比DMEM/SATO 和MEMO/SOS培养基对OPC形态和增殖能力的影响。B)  使用无血清补充物N2+B27(上部)或SOS (下部)对比神经上皮细胞从人类iPSC形成的拟胚体分化的效果。分化将近5周后产生神经元(β-III)和星形胶质细胞(GFAP)

 

订购信息:
 

货号 品名 产品描述
PKH/CellVue®活细胞标记试剂盒  
MINI26 PKH26 Red Fluorescent Cell Linker, 红色荧光,用于常规细胞膜标记,1x0.1ML
MIDI26 PKH26 Red Fluorescent Cell Linker, 红色荧光,用于常规细胞膜标记,2x0.1ML
PKH26GL PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit, 红色荧光,用于常规细胞膜标记,1x0.5ML
MINI67 PKH67 Green Fluorescent Cell Linker, 绿色荧光,用于常规细胞膜标记,1x0.1ML
MIDI67 PKH67 Green Fluorescent Cell Linker, 绿色荧光,用于常规细胞膜标记,2x0.1ML
PKH67GL PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit, 绿色荧光,用于常规细胞膜标记,1x0.5ML
PKH26PCL PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit, 红色荧光,用于吞噬细胞标记,1x0.5ML
MINCLARET CellVue® Claret Far Red Fluorescent Cell Linker Kits, 远红光,用于常规细胞标记,1x0.1ML
MIDCLARET CellVue® Claret Far Red Fluorescent Cell Linker Kits, 远红光,用于常规细胞标记,2x0.1ML
CGLDIL Diluent C for General Membrane Labeling 稀释液,用于常规膜标记
LuminiCell Tracker™荧光纳米粒子  
SCT010 LuminiCell Tracker™ 540- Cell Labeling Kit 含TAT序列的绿色荧光AIEDot纳米粒子
SCT011 LuminiCell Tracker™ 670- Cell Labeling Kit 含TAT序列的红色荧光AIEDot纳米粒子
SCT012 LuminiCell Tracker™ 540- Vascular Labeling Kit 不含TAT序列的绿色荧光AIEDot纳米粒子
SCT013 LuminiCell Tracker™ 670- Vascular Labeling Kit 不含TAT序列的红色荧光AIEDot纳米粒子
LentiBrite™荧光慢病毒生物传感器
17-10143 LentiBrite™ RFP-LC3 Lentiviral Biosensor RFP-LC3慢病毒粒子
17-10193 LentiBrite™ GFP-LC3 Lentiviral Biosensor GFP-LC3慢病毒粒子
17-10224 LentiBrite™ GFP-p62 Lentiviral Biosensor GFP-p62慢病毒粒子
17-10404 LentiBrite™ RFP-p62 Lentiviral Biosensor RFP-p62慢病毒粒子
17-10154 LentiBrite™ Paxillin-GFP Lentiviral Biosensor GFP- Paxillin慢病毒粒子
17-10155 LentiBrite™ Paxillin-RFP Lentiviral Biosensor RFP-Paxillin慢病毒粒子
17-10156 LentiBrite™ α-actinin-GFP Lentiviral Biosensor GFP-α-actinin慢病毒粒子
17-10196 LentiBrite™ α-actinin-RFP Lentiviral Biosensor RFP-α-actinin慢病毒粒子
17-10204 LentiBrite™ GFP-β-actin Lentiviral Biosensor GFP-β-actin慢病毒粒子
17-10203 LentiBrite™ RFP-β-actin Lentiviral Biosensor RFP-β-actin慢病毒粒子
17-10208 LentiBrite™ EB3-GFP Lentiviral Biosensor GFP-EB3慢病毒粒子
17-10222 LentiBrite™ EB3-RFP Lentiviral Biosensor RFP-EB3慢病毒粒子
17-10188 LentiBrite™ RFP-LC3 Control Mutant Lentiviral Biosensor RFP-LC3慢病毒粒子,突变体对照
17-10189 LentiBrite™ GFP-LC3 Control Mutant Lentiviral Biosensor GFP-LC3慢病毒粒子,突变体对照
17-10152 LentiBrite™ GFP-Vimentin Lentiviral Biosensor GFP-Vimentin慢病毒粒子
17-10153 LentiBrite™ RFP-Vimentin Lentiviral Biosensor RFP-Vimentin慢病毒粒子
17-10229 LentiBrite™ Histone H2B-GFP Lentiviral Biosensor GFP-Histone H2B慢病毒粒子
17-10228 LentiBrite™ Histone H2B-RFP Lentiviral Biosensor RFP-Histone H2B慢病毒粒子
17-10234 LentiBrite™ GFP-Rad51 Lentiviral Biosensor GFP- Rad51慢病毒粒子
17-10220 LentiBrite™ RFP-Rad51 Lentiviral Biosensor RFP- Rad51慢病毒粒子
17-10219 LentiBrite™ GFP-Cortactin Lentiviral Biosensor GFP- Cortactin慢病毒粒子
17-10218 LentiBrite™ RFP-Cortactin Lentiviral Biosensor RFP- Cortactin慢病毒粒子
17-10227 LentiBrite™ PSD95-GFP Lentiviral Biosensor GFP- PSD95慢病毒粒子
17-10226 LentiBrite™ PSD95-RFP Lentiviral Biosensor RFP- PSD95慢病毒粒子
17-10206 LentiBrite™ GFP-Tubulin Lentiviral Biosensor GFP- Tubulin慢病毒粒子
17-10205 LentiBrite™ RFP-Tubulin Lentiviral Biosensor RFP- Tubulin慢病毒粒子
17-10147 LentiBrite™ GFP-HMGB1 Lentiviral Biosensor GFP-HMGB1慢病毒粒子
17-10146 LentiBrite™ Calreticulin-RFP-KDEL Lentiviral Biosensor Calreticulin-RFP-KDEL慢病毒粒子
17-10409 LentiBrite™ RFP Control Lentiviral Biosensor RFP对照慢病毒粒子
17-10387 LentiBrite™ GFP Control Lentiviral Biosensor GFP对照病毒粒子
BrightCell™ 光稳定细胞培养基  
SCM143 BrightCell™ MEMO® Photostable Media, 100ml MEMO光稳定培养基,替代DMEM
SCM144 BrightCell™ MEMO® Photostable Media, 500ml MEMO光稳定培养基,替代DMEM
SCM145 BrightCell™ NEUMO® Photostable Media, 100ml 光稳定培养基,替代Neurobasal®培养基
SCM146 BrightCell™ NEUMO® Photostable Media, 500ml 光稳定培养基,替代Neurobasal®培养基
SCM147 BrightCell™ SOS® Neuronal Supplement (25X), 50ml 替代B-27、NS21、SATO和N2等

参考文献:

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