污染检测和去除

提到细胞污染,大家想到较多的是细胞中的细菌、浑浊的培养基、培养瓶中的非法入侵者等。此外,病毒和化学污染对细胞培养物的健康也非常重要,确保细胞株不存在交叉污染也是获得可重复结果的关键因素。

细胞培养过程中的污染问题到底有多普遍?FDA、ATCC及其他诸多研究表明,大约5-30%的细胞培养存在支原体污染;Merten的一项研究发现普通细胞株的病毒污染事件超过25%。

控制污染的关键是如何检测出污染。细菌、真菌和酵母污染物通常是肉眼可见的,或许能迅速杀死细胞,但微妙的形态可能使重要的微生物入侵者像支原体一样难以被检测到。相比之下,传统光学显微镜无法检测到病毒,因此病毒污染通常是在观察到无法解释的分离或细胞健康较差的其他迹象或甚至是细胞死亡时才被发现的。


 支原体污染检测和去除

支原体属的细菌不具有细胞壁,因此不受通过抑制细胞壁形成限制细菌生长的影响,其灵活的形态和0.15-0.3µm范围的细胞大小可以助其逃脱标准的细胞培养过滤方法(0.22µm孔径滤膜)。与大多数其他细菌污染物不同,随意检查和光学显微镜很难检测到支原体,培养物中支原体滴度可达到108个/ml而不引起培养基浑浊。它们通常不杀死感染的哺乳动物细胞,但可以通过改变细胞代谢、引起染色体畸变、延缓细胞生长和干扰细胞附着而显著影响细胞培养物。总之,支原体可能会严重影响大多数实验的结果。

实验室中支原体污染的不同来源是很大的挑战。人体皮肤上发现的支原体物种可通过较差的无菌技术和污染的补充物如血清进入培养物,而且支原体在相邻的污染细胞培养具有高度传染性。因此。支原体污染的预防、检测盒去除是至关重要的。

预防:

保证实验室环境和培养用具的清洁,使用0.1µm或更小孔径的滤膜过滤培养基和缓冲液。

LookOut® Mycoplasma Erase

支原体去除试剂可清洁和去除实验室表面和器具的支原体污染,包括清洁桌椅、工作台、培养箱、细胞储存盒、液氮容器等。该试剂是基于乙醇、无腐蚀性、非致癌的溶液,含有强效支原体去除试剂Mynox,可在几秒内完全去除支原体。可用于日常污染控制项目,解决已知或怀疑的支原体污染问题。

除了强效的支原体去除活性,该试剂还对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、粪链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、HBV/HIV、肿疡病毒、腺病毒、脊髓灰质炎、牛痘病毒科和TBC有效。

检测:

常用方法包括支原体培养、DNA染色和PCR检测,其中基于PCR的检测方法高度灵敏,可快速获得结果,因此成为目前广泛应用的方法

LookOut® Mycoplasma PCR Detection Kit

LookOut支原体PCR检测试剂盒基于PCR检测方法,是高特异检测细胞培养和细胞培养来源生物制剂中支原体、无胆甾原体和脲原体污染的理想选择。该方法利用热启动Taq DNA聚合酶的高特异优势和专利的引物设计进行优化,已成功扩增20-20000基因组拷贝浓度样本中支原体DNA片段。该试剂盒使用热启动Taq DNA聚合酶(货号:D9307)进行检测和优化,因此极力建议配合使用,如果使用其他Taq聚合酶可能需要进行反应优化以实现最佳效果。

该试剂盒中的反应管都预先包被了适当的dNTP和引物,使用非常方便,大大减少了总体实验时间。反应管中含有作为内控的DNA,成功的反应在琼脂糖凝胶中应该出现明显的481bp大小的条带。此外,反应管中还含有凝胶上样缓冲液和染料,PCR反应结束后可直接上样进行琼脂糖凝胶电泳。

 

检测样本:

  • 样本应该来自90-100%融合度的培养物
  • 细胞培养物上清可直接进行检测
  • 细胞株应该在不含支原体活性抗生素的培养基进行几天预培养以最大化检测灵敏度
  • 较老培养物中会积累PCR抑制物质,因此如果是较老培养物样本最好先进行DNA纯化
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

LookOut支原体PCR检测试剂盒根据支原体基因组保守的16S rRNA编码区设计,可以检测目前鉴定出的细胞培养中常见污染物的支原体物种及比如A. laidlawii、M. agalactiae、M. arginini、M. arthritidis、M. bovis、M. cloacale、M. falconis、M. faucium、M. fermentans、M. hominis、M. hyorhinis、M. hyosynoviae、M. opalescens、M. orale、M. primatum、M. pulmonis、M. salivarium、M. spermatophilumM. timone,但不适合检测M. pneumoniaeU. urealyticum或其他临床相关的物种。

LookOut® Mycoplasma qPCR Detection Kit

LookOut 支原体qPCR探针法检测试剂盒,为科研、工业应用和产品检测提供高灵敏度、高质量和可靠的支原体DNA定量检测方法,可直接检测细胞培养物和细胞培养物富集的生物制品。

该试剂盒包括内控DNA(一种可选的抑制控制),内控DNA可加入PCR反应液检测不完全PCR或完成DNA分离之前和过程中直接加入样本中。试剂盒中包括的内控探针在支原体阴性样本中通过扩增内控DNA而发出荧光。该试剂盒使用dUTP替代dTTP,适合UNG预处理,且已包含Taq聚合酶。

检测样本样本应该来自90-100%融合度的培养物,培养基中的青霉素和链霉素不抑制支原体也不影响测试灵敏度。在实际使用过程中,可根据样品类型的不同进行不同的实验前处理:

  • 细胞株应该在不含支原体活性抗生素的培养基进行几天预培养以最大化检测灵敏度
  • 较老培养物中会积累PCR抑制物质,因此如果是较老培养物样本最好先进行DNA纯化
  • 细胞培养物上清是优先推荐用于检测支原体的样本
  • 细胞团块应该先进行合适的DNA提取再进行检测,因为细胞碎片会干扰PCR反应
  • FBS、疫苗、石蜡包埋样品需要先进行DNA提取再进行检测

该试剂盒的引物/探针系统检测支原体基因组高度保守的23S rRNA操纵子编码区, 检测范围包括大部分细胞培养污染鉴定出的支原体物种,包括:


 支原体培养基

通过培养方法检测可培养支原体可在4周内获得结果,可检测细胞培养物和细胞试剂中的支原体。琼脂平板上观察到的支原体菌落形态类似“煎蛋”。

肺炎支原体呈现典型的“煎蛋式菌落”

去除:

当前灭活或消除细胞培养中的支原体通常使用基于抗生素的方法,但抗生素不总是能成功消除污染物。此外,抗生素具有细胞毒性特性,可能会修饰真核细胞代谢,促进耐药支原体菌株的发展。

LookOut® Mycoplasma Elimination Kit

LookOut支原体消除试剂盒由生物制剂混合组成,可快速、有效、可靠、完全的从细胞培养物中消除支原体污染。在大多数应用中,使用该试剂进行初步处理足以消除支原体,后续可使用抗生素处理进一步抑制和失活剩余的支原体。由于该试剂的毒性特性是最低的,经过初步处理可大幅度减少支原体浓度,因此耐药菌株的发展是极不可能的。

与其他消除、失活或抑制支原体的产品相比,LookOut支原体消除试剂盒更有效,而且尚未发现会引起任何正常细胞特征的改变,是细胞毒性最小的方法。

产品推荐

货号 品名 产品描述
支原体污染检测  
MP0035-1KT LookOut® Mycoplasma PCR Detection Kit PCR检测支原体污染/感染筛查
MP0040A-1KT LookOut® Mycoplasma qPCR Detection Kit qPCR探针法检测支原体污染
M0535 Mycoplasma Broth, suitable for microbiology 支原体肉汤,培养方法检测支原体污染
M0660 Mycoplasma Agar, suitable for microbiology 支原体琼脂,培养方法检测支原体污染
支原体去除    
MP0030-1KT LookOut® Mycoplasma Elimination Kit 从培养物中快速高效清除支原体
L1420-500ML LookOut® Mycoplasma Erase spray 清除实验室环境器具表面的支原体
L1545-1000ML LookOut®Mycoplasma Erase refill 清除实验室环境器具表面的支原体
L8917-250ML LookOut® DNA Erase Spray reagent 清除实验室环境器具表面的DNA污染
L9042-1L LookOut® DNA Erase refill 清除实验室环境器具表面的DNA污染


 微生物污染-细菌、真菌和酵母

细菌、真菌(包括霉菌)和酵母污染通常是肉眼可见为突发的细胞培养基浑浊和变色,标准的光学显微镜也能观察到细菌和真菌结果,因此日常的显微镜观察可以确保微生物污染的早日检出和采取相应的措施。

微生物污染的常见原因和预防措施
 

原因/根源 预防措施
移液操作和配剂
 非无菌表面和设备 清理工作区域
颈部、瓶外和工作台面溢出 定期酒精擦拭,不要倾倒液体,使用移液器或转移装置配剂
握持太靠近移液管头部,触摸旋盖内侧 握持移液管刻度以上部位
从废物杯中溅回 用漏斗把废物倒进烧杯,或者用真空吸走废物。
皮肤上的灰尘或颗粒落在培养物或瓶子上;手或器具放在打开的培养板/瓶/皿 不通过或在打开的培养板/瓶/皿上方操作
操作者的头发、手、呼吸,衣服
皮肤/头发/衣物上的灰尘掉落到培养物 洗净双手,穿不起毛的培养室专用实验服,束起长发或带帽子
说话,咳嗽,打喷嚏等产生的气溶胶 避免感冒工作或带口罩
溶液  
非无菌试剂和培养基 使用前过滤或灭菌
供应商QC流程较差 从信用良好质量和来源可靠的供应商处获取培养基、缓冲液等
仪器,移液管  
不可靠的无菌处理 从可靠供应商处购买独立包装、无菌和一次性的耗材
接触非无菌表面或其他材料 不要抓取将进入培养器皿的设备或移液管的任何部位
细胞株  
在源头或在运输过程中被污染。 选择可靠供应商,独立甚至是隔离操作这些细胞株,提前检测可能污染


 病毒污染

病毒是常见的最难检测的细胞培养污染物,它们可能来自病人或宿主动物细胞。由于病毒非常小,从培养基、血清和其他生物来源的试剂中移除病毒是比较困难。除了影响培养的细胞,使用病毒感染的细胞培养物还可能危害实验室人员的健康,因此在操作来源于人或其他灵长类动物组织或细胞时,需要做好特殊的安全措施以避免可能的病毒感染传播。

减少病毒污染事件的有效措施:

  • 限制生物来源的数量,包括供应商和动物材料
  • 选择不易感染病毒的动物/细胞
  • 从执行病毒检测和提供无病毒细胞株认证的储存库获得细胞

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