DNA/蛋白质电泳及故障排除表

 聚丙烯酰胺凝胶中DNA的有效分离范围

 

%丙烯酰胺(w/v)1 有效分离范围(bp)
3.5 1000-2000
5 80-500
8.0 60-400
12.0 40-200
15.0 25-150
20.0 6-100
1N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的含量是丙烯酰胺浓度的1/30。

 

 琼脂糖凝胶中DNA的有效分离范围

 

%琼脂糖(w/v) 线性DNA分子(kb)的有效分离范围
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-3
2.0 0.1-2

 

 加样染料的DNA大小迁移

 

琼脂糖浓度(%w/v) 二甲苯 溴酚蓝
0.1-1.5 4-5 kb 400-500 bp
2.0-3.0(筛分琼脂糖) 750 bp 100 bp
4.0-5.0(筛分琼脂糖) 125 bp 25 bp

 

 SDS-PAGE蛋白电泳疑难解答指南

 

问题 可能的原因 解决措施
微弱或缺失的蛋白条带 加样量低于染色剂的检测水平 检查A280并增加样品浓度
    使用更敏感的染色剂(例如银染)
  蛋白质没有固定在凝胶中 使用同样固定蛋白质的染色剂
    使用凝胶固定液
  小肽(<4kda)不固定在凝胶中 用5%戊二醛固定凝胶。染色前用水冲洗凝胶移液器吸头
  蛋白质被降解 检查A280并避免蛋白酶污染
  蛋白质跑出凝胶 使用较高浓度的PAGE凝胶。推荐凝胶浓度参见预制凝胶,如果大小未知,可使用4-20%凝胶
染色后在凝胶上成膜 沉淀考马斯蓝R 在甲醇中漂洗凝胶15秒,立即回到水中或脱色
波段分辨率差 蛋白浓度高 每蛋白负载10μg或每蛋白提取物100μg
  凝胶的年龄,由于碱催化 订购新鲜预制凝胶或浇铸新鲜凝胶
  凝胶浓度不当 推荐凝胶浓度参见预制凝胶,如果大小未知,可使用4-20%凝胶
波段涂抹 高盐浓度 透析样品,用TCA沉淀蛋白或使用脱盐柱
  蛋白浓度高 每蛋白负载10μg或每蛋白提取物100μg
  蛋白质聚集 样品中加入4-8 M尿素
  电压偏高 10-15v/cm电泳
孔内蛋白质沉淀 疏水蛋白 样品中加入4-8 M尿素
样品中的白色沉淀 SDS沉淀 可能是由于样品中存在胍盐或钾盐