表观遗传学

ChIP疑难解答问题

1. 在公告的第3页,组织准备程序要求在细胞培养基中用甲醛制作交联溶液,但在其他地方没有提及细胞培养基,为什么要用这种方法代替提取缓冲液?还可以用什么? 
细胞应在生理条件下(因此需要培养基)交联(X连锁),以便在体内发生时冻结和保存DNA-蛋白质相互作用。X连锁细胞随后在低渗溶液中肿胀,匀浆释放细胞核,在细胞核裂解缓冲液中提取染色质。

2. 如果少于8个样品,可以部分使用条带孔吗?
是的,可以随意使用少量的孔(取决于样品的数量)。

3. 如果超声处理不起作用,试剂盒是否与裂解酶兼容?
是的,也可以通过酶(微球菌核酸酶,MNase)消化(试剂盒中未提供的试剂/方案)得到剪切染色质。MNase处理的数量和持续时间将不得不由用户根据细胞系进行优化。

4. 做qPCR的GAPDH引物效率是多少? 
GAPDH引物做qPCR的效率是95%。

5. 我在超声处理方面遇到了麻烦。超声处理的推荐时间是多长? 
超声处理必须针对每个细胞系和仪器进行优化,我们推荐Diagenode Biodisruptor(水基超声处理)进行可重复的超声处理。一个好的起点是在高“H”设置下5、10和15分钟,30秒“开”和30秒“关”循环。

运行凝胶检查超声处理:

      i. 使用10微升样品并加入40微升H2O

     ii. 通过加入2微升5 M NaCl(最终浓度0.2 M NaCl)进行反向交联

    iii. 煮15分钟

    iv. 降到室温后,在37°C下加入1微升10mg/ml核糖核酸酶A处理10分钟

     v. 用Sigma公司的GenElute PCR纯化试剂盒清洗纯化DNA

    vi. 将1和4微升超声处理的DNA加载到凝胶上并测定涂片的大小

   vii.  给出DNA大小为200bp到1kb、峰值在500bp左右(2-3个核小体)的涂片的超声处理条件应该用于ChIP反应。

6. 核制备缓冲液的功能是什么?什么时候加入蛋白酶抑制剂? 
核制备缓冲液是一种低渗盐溶液,用于在随后的均质化步骤中使细胞膨胀并促进细胞核的释放。使用前应加入蛋白酶抑制剂混合物。

7. 这个试剂盒能和植物一起使用吗?爬行动物细胞呢? 
是的,该试剂盒与从植物或爬行动物细胞制备的超声处理染色质兼容,前提是用户具有优化的交联条件和制备适当大小的超声处理染色质。

8. 我们是否有酶消化DNA的方案而不是超声处理? 
不,我们没有优化酶消化染色质,但Pubmed搜索将揭示这些方案。

9. 因为在方案中的任何地方都没有发现DNA,我如何检测DNA是否被剪切?
运行凝胶检查超声处理:

      i. 使用10微升样品并加入40微升H2O

     ii. 通过加入2微升5 M NaCl(最终浓度0.2 M NaCl)进行反向交联

    iii. 煮15分钟

    iv. 降到室温后,在37°C下加入1微升10mg/ml核糖核酸酶A处理10分钟

     v. 用Sigma公司的GenElute PCR纯化试剂盒清洗纯化DNA

    vi. 将1和4微升超声处理的DNA加载到凝胶上并测定涂片的大小

   vii. 给出DNA大小为200bp到1kb、峰值在500bp左右(2-3个核小体)的涂片的超声处理条件应该用于ChIP反应。

10. 细胞数量能否增加?本试剂盒可使用的最大和最小细胞数是多少?
本试剂盒可用的细胞范围为0.1-100万个/孔/ChIP样品;如果每个孔使用100万个以上的细胞,会增加非特异性结合,降低ChIP反应的特异性。如果需要高产量的ChIP DNA,可以从多个单独的ChIP反应中汇集DNA进行下游处理(标记/杂交),也可以使用WGA 2试剂盒扩增DNA进行ChIP芯片分析。