功能性基因组学和RNA干扰(RNAi)

miRNA(microRNA)介绍

 介绍

成熟的microRNA(miRNA)是一类天然生成的小型非编码RNA分子,长约21-25个核苷酸。microRNA与一种或多种信使RNA(mRNA)分子部分互补,其主要功能是以各种方式下调基因表达,包括翻译抑制,mRNA剪切和脱腺苷化。microRNA首先于1993年1由Lee和他的同事进行了描述, 而microRNA这一术语是在2001年2创造的。随后通过随机克隆和测序或计算进行预测,来自于各种生物体中的数以千计的miRNA已经得到鉴定。由桑格研究所创办的miRBase,提供了miRNA命名,序列数据,注释和目标预测信息。

miRNA 产品

 miRNA的生成

miRNA Pathways

miRNA 生成途径

编码miRNA的基因比经过处理的成熟miRNA分子长得多。已知许多miRNA位于其前mRNA宿主基因的内含子中,并共享其调控元件、初级转录物,并具有相似的表达模式。对于其他的miRNA基因——需要从其自身启动子转录的miRNA,这类miRNA已经鉴定出少数几个初级转录产物。microRNA通过RNA聚合酶II被转录为名为pri-miRNA的大型RNA先导物,并由5'端帽子和polyA尾部组成。3pri-miRNA在细胞核中由微处理器复合物处理,该微处理器复合物由RNase III酶Drosha4,和双链RNA结合蛋白Pasha/DGCR8组成。5. T得到的pre-miRNA长度约为70个核苷酸,折叠成不完美的茎环结构。然后pre-miRNA通过karyopherin exportin 5(Exp5)和Ran-GTP复合物输出到细胞质中。6. Ran(ras相关核蛋白)是一种属于RAS超家族的小型GTP结合蛋白,对于RNA和蛋白质通过核孔复合体至关重要。7Ran GTPase结合Exp5并与pre-miRNA形成核异源三聚体。6,8一旦进入到细胞质中,pre-miRNA经过RNAse9 III酶Dicer的另外处理步骤产生长度约为22个核苷酸的双链RNA。10Dicer同时也启动了RNA诱导沉默复合物(RISC)的形成。RISC负责由于miRNA表达和RNA干扰而观察到的基因沉默。11

 Dicer的功能

Dicers是包含ATPase/RNA解旋酶,DUF283(功能域未知)域,PAZ(Piwi,Argonaut和Zwille)域的大型200kDa的蛋白质,其可以结合mi和siRNA的特征性双碱基3'突出端,两个催化性RNase III结构域(RIIIa和RIIIb)和C末端双链RNA结合结构域(dsRBD)。Dicer作为一种单体发挥作用,并具有一个处理中心,处理中心具有分子内二聚化的两个RNase III结构域。每个RNase结构域独立地切割双链体的一条RNA链以产生具有2-nt 3'突出端的产物。除了从pre-miRNA剪切得到miRNA之外,Dicer酶还将dsRNA加工成siRNA。在Dicer切割之后,miRNA的生成途径类似于动物中RNA干扰(RNAi)的主要步骤。与siRNA不同的是,microRNA可以指导RISC通过翻译抑制(基于miRNA和mRNA之间的较低互补性)下调基因表达,或者作为siRNA进行并介导mRNA切割。转录后机制的选择不是由沉默RNA(siRNA或miRNA)的来源决定的,而是由互补程度决定的。如果miRNA与其靶标完美或几乎互补,则可特异性切割靶mRNA。内源表达的miRNA通常与其靶基因不完全互补,并通过翻译抑制调节对基因表达的影响。12.

 RISC复合体

当切酶切割pre-miRNA茎环时,形成两个互补的短链RNA分子,但只有一个会整合到RISC复合物中。RISC是含有Argonaute(Ago)家族蛋白质成员的核糖核蛋白复合物。Argonaute蛋白具有针对与其结合的miRNA片段互补的mRNA链的核酸内切酶活性。Argonaut还负责选择引导链和破坏随从链。所引入的链被称为引导链,引导链由argonaute蛋白根据其5'端的稳定性进行选择。称为随从链(*)的剩余链被降解为RISC复合物底物。dsRNA引导链的选择似乎主要基于dsRNA两端末端的稳定性。13双链体5'末端2-4 nt的碱基配对稳定性较低的链优先与RISC缔合,从而成为活性miRNA。13整合到活性RISC复合物中后,miRNA通过结合mRNA靶标的3'非翻译区(UTR)内的不完全互补位点发挥其调节作用。由miRNA的结合产生双链RNA,而双链RNA导致翻译抑制。

 研究中的miRNA

虽然第一个miRNA是在十年前被发现的,但是直到最近,研究人员才开始了解这些调控分子的范围和多样性。越来越多的证据表明,miRNA表现出与细胞生长,发育和分化有关的各种关键调节功能,并与各种人类疾病有关。几个miRNA已被发现与癌症14,15和心脏病有关。16表达分析研究揭示了与正常组织相比肿瘤中miRNA表达受到干扰。15microRNA在乳腺癌,肺癌和结肠癌中失调,并在Burkitt's和其他人类B细胞淋巴瘤中上调。因此,人类miRNAs可能作为生物标记物会非常有用,特别是对于未来的癌症诊断,有关miRNA的研究正在迅速成为疾病干预领域的具有吸引力的研究方向。除了与癌症相关之外,microRNA还在控制心脏功能和功能障碍的多个方面中起重要作用。包括心肌细胞的生长,心室壁的完整性,收缩性,基因表达和心律的维持。研究表明miRNA的错误表达与多种形式的心脏疾病是具有绝对关联性的。16

 miRNA研究产品

不言而喻,miRNA研究具有很大的潜力,可能成为未来许多尖端医疗疗法的中坚力量。为了跟上各领域学者对miRNA日益增长的兴趣,Sigma对这个快速发展的研究领域跟进了强有力的资源投入,并正在为我们的客户开发全面的产品组合,包括miRNA分离,扩增,分析和功能分析。mirPremier microRNA 分离试剂盒 进一步完善了功能已经非常强大 MISSION® RNAi 的产品线,其中包括了MISSION siRNA, MISSION miRNA mimics 和 shRNA 产品 和shRNA的产品等广泛的选择,同时也提供库试剂盒,基因检测试剂, 抗体 and AQUA™ 肽 用于蛋白质水平检测。支持整个实验流程的试剂,包括 细胞培养, 细胞生物学化合物 和分析工具,转染试剂等等),欲了解更多信息,请访问功能基因组学 & RNAi 主页

 miRNA 产品

MISSION® 人类 miRNA 模拟物

人类miRNA模拟物库试剂基于MirBase ver.21。规格可以是库试剂板(96孔板格式,0.25 nmol/孔)和单独的管样品(5 nmol)。该新型MISSION miRNA模拟物设计已针对天然miRNA靶标的敲低效率进行功能测试,并降低了可能的脱靶效应。

MISSION® 目标 ID库 

The MISSION 目标ID库 可以使得台式转录组范围内的人类miRNA和ncRNA基因得以识别。利用创新的双阳性选择系统,可以以最少的时间,试剂或资本设备费用,为任何研究人员提供快速的全转录miRNA和ncRNA基因目标筛选。

MISSION ®   3'UTR Lenti GoClone由SwitchGear Genomics™提供支持

Sigma-Aldrich已经与SwitchGear基因组公司合作提供了MISSION 3'UTR Lenti GoClones的全基因组收集。人3'UTR基因与SwitchGear的新型RenSP报告基因融合,新系统利用病毒载体传递人3'UTR基因。LightSwitch萤光素酶测定试剂专门设计用于RenSP,并提供最大灵敏度,动态范围和方便性。

 参考文献

  1. Lee R. C. et al. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 1993 75, 843–854.
  2. Ruvkun, G. Molecular Biology: Glimpses of a Tiny RNA World. Science 2001, 294, 797–799.
  3. Lee Y. et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 2004, 23, 4051–4060.
  4. Han, J. et al. The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes Dev. 2004, 18, 3016–3027.
  5. Denli, A. M. et al. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 2004, 432, 231–235.
  6. Yi, R. et al. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short Hairpin RNAs. Genes Dev. 2003, 17, 3011–3016.
  7. Moore, M. S. et al. The GTP-binding protein Ran/TC4 is required for protein import into the nucleus. Nature 1993, 365, 661–663.
  8. Lund, E. et al. Nuclear export of microRNA precursors. Science 2004, 30, 95–98.
  9. Bernstein, E. et al. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 2001, 409, 363–366.
  10. Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 2005, 579, 5822–5829.
  11. Hammond S. M. et al. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 2000, 404, 293–296.
  12. Filipowicz, W. et al. Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. Curr. Opin. Struct. Biol. 2005, 15, 331–341.
  13. Schwarz, D. S. et al. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 2003, 115, 199–208.
  14. Croce, C. M. Molecular origins of cancer: Oncogenes and Cancer. N. Engl. J. Med. 2008, 358, 502–511.
  15. Meltzer P. S. Cancer genomics: Small RNAs with big impacts. Nature 2005, 435, 745–746.
  16. van Rooij, E. et al. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. J. Clin. Invest. 2007, 117, 2369–2376.

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