miRNA研究工具

使用MISSION®慢病毒microRNA抑制剂阐明miRNA功能

 慢病毒质粒载体中的microRNA抑制

MicroRNA抑制对于研究其功能至关重要。我们提供了一系列独立的microRNA抑制剂,它们采用基于Tough Decoy (TuD)设计的专利算法而设计。1 每种miRNA抑制剂经过克隆和测序验证,确保与目标miRNA匹配。

 

 慢病毒miRNA抑制剂的优势

  • 强效抑制目标miRNA
  • 慢病毒形式可将抑制剂高效转染至各类细胞中
  • 长效抑制作用,无需重复转染

慢病毒miRNA抑制剂设计

图1. 慢病毒miRNA抑制剂表达调控miRNA功能
基于慢病毒转移载体向转导后宿主细胞内的基因组整合,miRNA抑制剂的表达受到hU6启动子的驱动。miRNA抑制剂能够与特异miRNA竞争性结合,阻止它们调控内源靶标。

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 应用数据

利用双荧光素酶检测验证慢病毒miRNA抑制剂

图2. 双荧光素酶检测:HeLa慢病毒miRNA抑制剂细胞系
使用携带指定miRNA抑制剂的慢病毒稳定转导HeLa细胞,将其培养至少2周,然后使用目标miRNA相应的双荧光素酶报告基因转染细胞。计算每个待测细胞系的海肾:萤火虫荧光素酶发光比值,并与对照抑制剂细胞对比。抑制剂表达细胞的海肾:萤火虫发光比值高于对照细胞,表明抑制剂有效。

miR-206抑制上调Notch3表达

图3. HeLa慢病毒miRNA抑制剂细胞系中Notch3的qRT-PCR
miR-206已被证明可调节HeLa细胞中Notch3的表达。为确认miR-206抑制剂可以改变miR-206对其内源性下游靶标的作用,对来自稳定表达miR-206抑制剂或对照抑制剂的HeLa细胞的总RNA进行qRT-PCR检测。Notch3的表达比对照细胞高78%,表明有效抑制了该细胞系的miR-206。

提高MOI可能会增强miRNA抑制

图4. HepG2细胞中miR-21的双荧光素酶检测
通过提高感染复数(MOI),可增强miRNA抑制作用。使用不同MOI的对照慢病毒miRNA抑制剂或miR-21抑制剂稳定转导HepG2细胞,然后使用miR-21的双荧光素酶报告基因载体转染,并计算相应的荧光素酶比例。结果表明,海肾:萤火虫荧光比例随MOI升高而升高,因此,可通过提高慢病毒抑制剂的MOI来增强特异miRNA的抑制效果。

miR-21抑制上调RHOB表达

图5. HepG2慢病毒miRNA抑制剂细胞系中RHOB的qRT-PCR
miR-21已被证明可调节肝细胞中RHOB的表达。为进一步验证miR-21抑制剂,对来自稳定表达miR-21抑制剂或对照抑制剂的HepG2细胞的总RNA进行qRT-PCR检测。RHOB的表达比对照细胞高55%,表明有效抑制了该细胞系的miR-21。在HeLa细胞的相同靶点和抑制剂组合中,获得了几乎相同的结果(数据未显示)。


参考文献

  1. Haraguchi, T., et al., Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in mammalian cells. Nucleic Acids Res., 37, (2009).