shRNA

骨髓源性巨噬细胞转化实验方案

货号 SHM01

Sigma® MISSION®团队Pat Blanner、Chris Bauer、Jason Books、Alex Hromockyj的授权实验方案;位于圣路易斯的Pfizer全球研发团队中的免疫通路小组

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材料

  • 雄性DBA小鼠
  • 10毫升注射器
  • 30号针头
  • 水平转头离心机
  • T-75培养瓶(C7231)
  • T-150培养瓶(CLS430825)
  • 60 mm Petri培养皿(CLS430166)
  • 96孔板(CLS3595)
  • ExpressMag超磁性试剂盒(SHM01)
  • 不含酚红MEM基础培养基,添加L-谷氨酰胺
  • 生长培养基 – 不含酚红MEM基础培养基,添加:L-谷氨酰胺,10% FBS, 抗真菌素,抗生素,20 ng/ml M-CSF (M9170)
  • 选择培养基 – 生长培养基中加入 3 µg/ml嘌呤霉素(P9620)
  • DPBS DI – Dulbecco磷酸盐缓冲液(D8662),每次添加1.5 mg/ml现配的分散酶(D4818)
  • LPS (L4641)
  • 组织培养箱-37 °C,5% CO2,100%相对湿度
  • 组织培养层流罩 - 组织培养罩中仅开启优化板
  • 带有水平转头的离心机
  • MISSION慢病毒(如SHC002V )
  • 无菌细胞刮

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实验方案

 

第1天
  0.1   确定所需的股骨数量,预计在最后大概每根股骨会有约150万的BMDM。
  0.2   制备20 ml的MEM基础培养基并放置在冰上。
  0.3   预加热生长培养基至37 °C。
  0.4   经研究机构批准对小鼠实施安乐死。
  0.5   去除小鼠的股骨并立即放置经冰冷的MEM基础培养基中。
  0.6   用10毫升针头和30毫升注射器将骨髓从股骨抽至60 mm培养皿中。
  0.7   缓慢吹打骨髓至分散。
  0.8   1,000 RPM室温离心5分钟。
  0.9   弃上清,注意不要分散细胞沉淀。
  0.10   立即加入20 ml预加热的生长培养基并通过吹打缓慢重悬。
  0.11   转移至T-75并在组织培养箱中孵育过夜。
 
第2天
  1.1   预加热生长培养基。
  1.2   转移至无菌50 ml锥形管中。
  1.3   1,000 RPM室温离心5分钟。
  1.4   用50 ml生长培养基重悬沉淀。
  1.5   转移至T-150。
  1.6   重新放至组织培养箱中。
 
 
第4天
  3.1   预加热生长培养基。
  3.2   更换细胞培养基。
  3.3   将培养瓶重新放至组织培养箱。
 
第6天
  5.1   预加热生长培养基。
  5.2   去除培养瓶中的培养基。
  5.3   每瓶中加入10 ml的DPBS DI,并轻柔地将细胞刮下。
  5.4   进行细胞计数。
  5.5   1,000 RPM室温离心5分钟。
  5.6   1x106 cells/ml浓度用生长培养基重悬细胞。
  5.7   按要求向96孔板的每孔中加入含有细胞100 μl的培养基。
 
第7天
  6.1   T解冻MISSION慢病毒。
  6.2   按MOI值为8计算每孔所需要的病毒体积(Vv, ul)。
  6.3   根据以下公式计算每孔所需的DMEM (Dv)体积,以结合病毒至磁珠上后加入DMEM至空管中。Dv=50-Vv-1.5。
  6.4   向每孔中的DMEM中加入1.5 μl的ExpressMag磁珠(SHM03
  6.5   缓慢吹打以混匀。
  6.6   每孔中加入50 ul的混合物。
  6.7   将96孔板室温置于超磁性板上15分钟。
  6.8   返还细胞至组织培养中过夜保存。
 
第8天
  7.1   预加热选择培养基。
  7.2   去除96孔板中的培养基。
  7.3   每孔替换加入100 ul的选择培养基。
  7.4   重新放至组织培养箱。
 
第10天
  9.1   重复7.1 – 7.4的过程。
 
第12天
  11.1   进行相应的检测。

 

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