shRNA

采用细胞毒性谱对抗生素筛选进行优化

由MISSION®团队所提供的实验方案

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简介

用于筛选稳定细胞系的最佳抗生素浓度对于每种细胞类型是不同的。如果所需细胞类型的浓度未知,则必须进行滴定实验以确定有效选择转导细胞所需的最低抗生素浓度。在此实验方案里,我们特别突出了与标准pLKO.1载体配套使用的嘌呤霉素。通常,1-10 µg/ml的浓度便足以杀死绝大多数未转导的哺乳细胞类型。点击此处查看一系列细胞系推荐的起始浓度。该操作流程也可用于对定制shRNA载体所需的G148最佳浓度进行确定。参看定制 shRNA 页面以获取更多信息。超出抗生素绝对必须的高浓度将会导致脱靶效应和更少可用于下游分析的细胞。

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 材料

  • 细胞 – 处于对数生长期并在转染当日达到50%的密度
  • 细胞培养基
  • 组织培养箱 - 37 °C,5% CO2,100%相对湿度
  • 抗生素嘌呤霉素 (P9620) 或 G418 (A1720)

实验方案

第1天
0.1 在每孔中加入50%密度的细胞至完全培养基中。在3行 x 11列中加入细胞用于细胞毒性检测
0.2 将细胞放回培养箱并孵育过夜
第2天
1.1 将5ml完全培养基预加热。
1.2 在完成培养基加入11组嘌呤霉素至终浓度分别为:0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 7, 8, 9, 10 µg/ml,并设置三重复。每种稀释液的最终体积应最少为110 ul。
1.3 将细胞放置进培养箱.
1.4 弃培养基.
1.5 将培养基更换为含有抗生素的培养基
1.6 重复1.1至1.6的操作.
第4天
3.1 重复1.1至1.6的操作.
第6天
5.1 重复1.1至1.6的操作.
第8天
7.1 重复1.1至1.6的操作.
第10天
10.1 通过细胞计数或活性检测对每孔中的细胞活性进行测定。
10.2 可在通过嘌呤霉素筛选7-10天后导致细胞完全死亡的最小嘌呤霉素浓度应用于该细胞类型的shRNA病毒颗粒转导。

 

 要点

如果在加入嘌呤霉素后小开始变圆但又未从平板表面脱落时:

  • 变圆是细胞将要死亡但尚未从表面脱落的标志。这些细胞还需要更多的时间才会死亡。
  • 如果细胞需要高于推荐的1-10 μg/ml嘌呤霉素浓度,则需要检查嘌呤霉素是否过期并避免反复冻融(小于5次)

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