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MISSION® shRNA入门

为什么选择 shRNA?

使用对照物
从细菌甘油原液开始
从纯化的质粒DNA开始
从慢病毒转导颗粒开始
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为什么选择 shRNA?



使用RNA干扰的基因沉默和敲低越来越常见。将小分子干扰RNA (siRNA)导入培养细胞提供了一种快速有效敲低基因表达的方法,并使siRNA迅速成为分子生物学中普遍使用的工具。已有证明表明siRNA在某些转化的哺乳动物细胞系中对短期基因抑制有效,而shRNA可有力且稳定地沉默基因表达。

长期稳定的基因沉默可区分来自其他RNAi工具的短发夹RNA构建体(shRNA)。对于转换较慢或可能较慢的基因,利用shRNA进行长期沉默不仅方便,而且是唯一的选择。对于这些蛋白质,可以在细胞有效降解mRNA之前稀释siRNA。长期的基因沉默可以通过使用pLKO.1质粒进行标准克隆选择、然后进行嘌呤霉素选择来实现。MISSION®生物生产团队可以为您提供远比克隆选择、慢病毒递送shRNA MISSION TRC(什么是TRC?)更有效、更少偏见的解决方案。shRNA慢病毒构建体可以很容易地转导通常较难的细胞系(如原代细胞和非分裂细胞),并容易地将shRNA整合到这些细胞的基因组中进行稳定的基因沉默。

Sigma-Aldrich 保证 在shRNA详细信息页上为您的目的基因购买了限定的克隆组数量(这是不同的,但通常是5个克隆)后,至少一个基因克隆可产生大于70%的敲低。

查看Sigma®研发团队和独立研究人员的应用数据

查看 已成功使用并用MISSION TRC库发表的人员的参考资料

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使用参照物


使用MISSION TRC shRNA构建体进行实验时,恰当的对照物是实验设计的关键要素,以便准确解释敲低结果。所有对照物都可用于纯化的质粒DNA和慢病毒颗粒形式。

另外,使用MISSION TurboGFP™对照转导颗粒(SHC003V)可优化第一次使用一种细胞系时的转导效率。

Sigma推荐的用于任何shRNA实验的对照物在 shRNA 对照网页 中提供,并与Nature Cell Biology社论中提出的对照物密切一致。1



参考文献:

1. Whither RNAi? Nature Cell Biology, 2003, 5, 489-490 (2003).

 

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从细菌甘油原液开始


MISSION TRC shRNA细菌甘油原液为shRNA构建体提供可再生资源。载体可直接用于瞬时转染或稳定转染,或者用于在包装细胞系中与 包装质粒 一起产生慢病毒颗粒。


访问  载体图谱 网站

MISSION SHRNA 细菌甘油原液技术公告 (583 Kb PDF)


故障排除:

问题 原因 解决方案
选择平板上没有细菌培养物生长 羧苄青霉素浓度不当 重新检查羧苄青霉素浓度或倒入含有100 μg/ml羧苄青霉素的新板中。
冷冻培养物接种量不足 从冷冻的甘油中去除大量培养物。
冷冻培养物的储存温度不足 储存温度必须在-70℃或更低。获取新的原液。
多次冻融循环 避免冻融2次以上。
质粒产量低 构建困难 对产量低的构建体进行更多纯化(中度或最大制备)。
无法使用单个菌落进行接种 使用分离的菌落接种用于DNA制备的培养物。

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从纯化的质粒DNA开始


MISSION TRC shRNA纯化的质粒DNA形式免去了由每个构建体制备DNA的麻烦。DNA可直接用于瞬时转染或稳定转染,或者用于在包装细胞系中与包装质粒一起产生慢病毒颗粒。为每个构建体提供1 μg DNA。

 

访问 载体图谱 网站

 

MISSION shRNA 质粒DNA技术公告 (561 Kb PDF)

MISSION TRC shRNA纯化的质粒DNA构建体与大多数市售的转染试剂相容。一些细胞系可能比其他细胞系对转染更敏感/有抗力。使用MISSION TurboGFP对照载体(SHC003)可以优化转染效率。

我们提供涵盖多种细胞类型的各种 转染试剂

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从慢病毒转导颗粒开始


MISSION TRC shRNA慢病毒转导颗粒形式提供了极大的便利。转导颗粒可直接添加到细胞中。几乎可以转导任何哺乳动物细胞系,包括原代细胞和非分裂细胞。

高通量慢病毒颗粒生产结果


MISSION shRNA 慢病毒转导颗粒技术公告 (110 Kb PDF)


选择细胞系
用VSV-G包膜蛋白将MISSION TRC慢病毒颗粒假型化。这可将含有shRNA的慢病毒颗粒有效转导到大多数哺乳动物细胞系中。第一次用一种细胞系优化转导所需的慢病毒颗粒数量时,建议使用MISSION TurboGFP对照转导颗粒(SHC003V)。这种重要的阳性对照表达绿色荧光蛋白标志物TurboGFP,可用来监测实验设计和帮助解释结果。ExpressMag® 转导系统可进一步增强转导。该系统利用纳米颗粒和强大的稀土磁体组合增强慢病毒转导效率。

您的细胞系是否经过慢病毒转导验证?



选择检测实验
确定评估靶基因表达和敲低所要进行的检测实验,这一点至关重要。可进行多种分析来确定mRNA转录水平、蛋白水平或表型反应。在确定分析方法时,请记住,敲低必需基因可能会对细胞致命,并影响您进行的分析类型。


mRNA转录分析

蛋白质定量测定
AQUA
免疫印迹

表型分析
肿瘤标志物
细胞活力和增殖
细胞信号转导


感染复数 (MOI)
感染复数是每个细胞转导慢病毒颗粒的数量。对于要转导的每种新细胞类型,强烈建议进行一系列MOI测试。可以通过增加/减少每个孔的细胞数或增加/减少每个孔中加入的上清液的量来调节MOI。这可确定所用每种细胞系进行有效转导所需的慢病毒上清液的最佳量。我们推荐5、1、2和5的检测MOI。

计算方法:

(每个孔的细胞总数)×(期望的MOI)=所需的总转导单位(TU)

(所需的总TU)/(A中C的TU/ml)=每个孔中添加的慢病毒颗粒的总ml数


嘌呤霉素滴定(使用选择时)
在使用新细胞类型时应进行嘌呤霉素滴定(杀伤曲线)。

  1. 将 1.6 x 104 个细胞接种到96孔板的孔中,其中每孔含120 µl 新鲜培养基。
  2. 第二天,向选定的孔中加入500-10,000 ng/ml的嘌呤霉素。
  3. 每2天检查一次活力。
  4. 培养10-14天。每3天更换一次含嘌呤霉素的培养基。
  5. 对于该细胞类型,应使用3-5天后可导致细胞全部死亡的最小嘌呤霉素浓度。

MISSION 实验方案 网站上,提供了面向所有人的有益shRNA实验方案列表。

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首次订购

MISSION TRC shRNA文库可在线订购。首先,您必须创建在线个人资料,并勾选表单上的“请求网站订购权限”框。个人资料创建和审核完之后,就能将克隆产品添加到购物车。



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MISSION为Sigma-Aldrich Co的注册商标。LLC 标签许可证。

TurboGFP为Evrogen的商标。

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