功能性基因组学 & RNAi

采用包装质粒混合物制备病毒转导颗粒

货号 SHP001

由 MISSION®团队所提供的实验方案

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 简介

MISSION® 慢病毒包装混合物是可两种可表达关键HIV包装基因以及异种病毒包膜基因质粒的一种优化配方。MISSION® 慢病毒颗粒由三个主要组分所产生:

  1. 包装载体,含有可产生病毒结构蛋白和包装功能所需的最小慢病毒基因组合。
  2. 水疱性口炎病毒G蛋白(pCMV-VSVG)包膜载体,可为伪装病毒的产生提供异种包膜
  3. shRNA转移载体(pLK0.1),含有目标序列以及RNA生成和包装必需的顺式作用序列。

 材料

  • 293T细胞(对数期生长并在转染当日具有70%的密度)
  • 培养基 – 添加有10%胎牛血清(D6429) 和4mM L-谷氨酰胺 (F2442) 的DME培养基 (G6392)
  • 转染试剂
  • 96孔组织培养板
  • 组织培养箱—37 °C,5% CO2,100%相对湿度
  • 组织培养层流罩 – 仅在组织培养罩中打开优化板
  • 慢病毒包装混合物 (SHP001)

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实验方案

第1天
  0.1   在完全DME培养基中加入HEK293T细胞(96孔板每孔20,000个细胞).
 
第2天
  1.1   室温条件下将慢病毒包装混合物解冻并置于冰上。
  1.2   将三支空的聚丙烯管置于冰上。
  1.3   向第一支管中按每孔1 ul的量加入慢病毒包装混合物。
  1.4    
  1.5   向第三支管中加入0.1 µg/孔的shRNA转移载体。
  1.6   将所有的转染组分都汇集至一个聚丙烯管中
  1.7   上下吹打轻轻混合。
  1.8   室温孵育15分钟。
  1.9   将混合物均匀分配到待转染的每个孔中。
  1.10   在组织培养中37 °C孵育过夜。
 
第3天
  2.1   在转染16小时候,小心去除培养板中的培养基(避免对细胞产生干扰)并向每孔加入100ul预热的完全培养基。
  2.2   培养箱(37 °C及5% CO2)中再将细胞孵育24小时。
 
第4天
  3.1   在进行至3.2步前带上双层手套。
  3.2   小心吸出已带有病毒的上清,并加入至收集板中。
  3.3   加入新鲜的完全DME培养基,并在37 °C孵育过夜。
  3.4   将收集板盖板并储存在4 °C下。
 
第5天
  4.1   在进行至4.2步前带上双层手套。
  4.2   小心吸出已带有病毒的上清,并加入至前一天的收集板中。
  4.3   通过p24 ELISA对滴度进行测量。
  4.4   将病毒进行严格的密封并储存在–80 °C。

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 要点

通过实验可确定第一次收集的滴度将会略高于第二次,但将两者进行混合并不会显著降低样品的整体滴度。

第1天

  • HEK293T细胞因保持在一定的传代数内。
  • 接种细胞过夜,在转染前不要超过24小时。

第2天

  • 检查产品的体积和外观。
  • 为了产生最佳的滴度和可重复结果,因采用无内毒素的方法进行载体的制备。仅使用无菌的聚丙烯管以防止污染。
  • 过度混合将会损坏转染复合物的形成。在孵育的过程中不要对管进行干扰因为转染复合物正是在此期间形成。
  • 向细胞中缓慢的加入转染混合物,从中心向孔的周围以顺时针的方式均匀加入液滴。

第3天

  • 第一批收集的病毒可在2–8 °C储存24-48小时

第5天

  • 每次冻融都会引起滴度的降低。推荐将病毒进行分装至小包装并储存在–70 °C直至使用

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