shRNA

Spinoculation实验方案

MISSION®TRC shRNA文库是基于慢病毒的shRNA载体集,用于基因敲低研究。该实验方案描述了MISSION TRC shRNA慢病毒颗粒的应用,特别是对悬浮细胞进行长期沉默和表型观察。以下方案提取自文献1 用于含有MISSION慢病毒颗粒的6孔板。

还对ExpressMag™系统 (SHM01SHM02) 进行了优化,以在比该实验方案更少的24小时内在多种组织培养形式中转导悬浮细胞。

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 材料

MISSION慢病毒颗粒

利用 SHC002VSHC001V for optimizing transduction protocol. Transduction of SHC003V 优化转导实验方案。SHC003V的转导可以通过FACS或荧光显微镜进行监测,但是该实验方案不在本文的范围之内。首先要优化您的实验方案,保证您对转导效率充满信心。这将从转导效率中解构出慢病毒有效载荷(shRNA或定制有效载荷)的影响。然后,当切换到表达shRNA的MISSION慢病毒时,所得到的菌落或活细胞数量的任何变化都可以归因于shRNA的作用,并且不能归因于低转导效率。转导效率得到优化后,利用表达目标基因shRNA的MISSION慢病毒颗粒或表达任何shRNA或目标基因的定制MISSION慢病毒颗粒

嘌呤霉素 (P9620)
供选择的10 mg/mL储液

完全培养基
对于Jurkat细胞,包含10%热灭活的胎牛血清的DME或适合您的细胞类型的培养基。

台盼蓝 (93595)

12 x 15 mL 锥形管 (CLS430790)

6孔组织培养板 (CLS3516)

摇摆斗式离心机
离心机应配备温度控制器,并且在细胞转导之前预热至32℃。

血细胞计数器 (Z359629)
血细胞计数器用于细胞计数。

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 实验方案

  1. 确定筛选要使用的最终嘌呤霉素浓度。确切的浓度是细胞系依赖性的,应通过对未转导的细胞进行72小时的细胞毒性测试来确定。
  2. 只使用无菌物品,并在整个过程中使用标准的组织培养无菌技术。
  3. 将所有培养基预热至37℃。
  4. 对培养的活Jurkat细胞进行计数。
  5. 将Jurkat细胞稀释到完全培养基中,终浓度为1x105个细胞/mL,终体积为14 mL。
  6. 将2 mL 1x105个细胞/mL转移到6个15 mL无菌锥形管中。
  7. 将MISSION慢病毒颗粒溶液加到Jurkat细胞中,使得每个锥形管的最终感染复数(MOI)等于0、0.1、0.5、1.0、5.0或10。0 MOI表示您的未转导的阴性对照。
  8. 在32℃下以800 x g将细胞离心30分钟。
  9. 根据惯例,吸出含病毒培养基并进行适当处理。
  10. 通过上下轻轻吹打团块将每份细胞团块重悬于2 mL培养基中,并将每份重悬的团块转移至6孔组织培养板中的各自孔中。
  11. 将板放回组织培养箱,培养三天。
  12. 3天后,将细胞转移到6个单独的15 ml锥形管中,并以200 x g离心5分钟。弃去培养基,并用2 ml含嘌呤霉素的完全培养基替换。
  13. 将组织培养板放回培养箱过夜。
  14. 将细胞维持在嘌呤霉素中,直到通过检查或台盼蓝染色确定未转导的阴性对照细胞死亡。

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 附注

用下面的公式计算孔的MOI。病毒滴度将在Sigma的分析证明书中提供。病毒体积是加到含有待转导细胞的孔/离心管中的体积,以mL为单位。细胞数等于孔/离心管中活细胞的总数。

参考文献

  1. O'Doherty, U.; Swiggard, W. J.; Malim, M. H. J Virol 2000, 74, 10074-10080.

MISSION 为Sigma-Aldrich Co的注册商标。LLC
ExpressMag 为Sigma-Aldrich Co的注册商标。LLC

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