shRNA

专题文章


MISSION shRNA

By Stephanie Uder, Henry George, and Betsy Boedeker
Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

简介


RNA干扰技术最早的形式出现在1998年一项Caenorhabditis elegans1研究中,并且很快演变成现在的形式,成为了基因功能、生物通路和疾病生理研究的革新性方法。早期矮牵牛花的研究显示一种现象(专业名称为共抑制),同源转基因的过表达导致该转基因和内源基因均表达沉默。2 随后C. elegans实验提供了突破性发现,证明是双链RNA(dsRNA)干扰基因功能。这一发现被称为RNA干扰或RNAi。

 

最近几年,RNAi技术功能研究和改良一直在不断更新中。我们现在知道了内源RNAi通路基本机制3 ,这一通路在大多数真核生物中都存在。我们还知道了如何利用细胞器实现基因表达沉默。研究者发现了使用片段长度小于30碱基(bp)的干扰小RNAs(siRNAs)的关键规律和参数,能够在哺乳动物细胞中使用dsRNA而不会引发细胞抗病毒反应机制4。关于转染、合成siRNAs被核糖核酸酶Dicer酶旁路切割(图1)并且掺入RNAi诱导沉默复合体(RISC)。RISC解旋双链siRNAs,被激活的复合体和反义siRNAs链结合同源mRNA转录本进行切割和后续降解。转录水平的降低导致目标蛋白水平降低,导致表型改变。基因沉默或敲低水平可通过qRT-PCR等方法测定mRNA转录水平来测定,也可通过免疫印迹、ELISA以及最近新研发的基于质谱的蛋白质定量方法(如AQUA™技术)测定蛋白质水平来测定。

 

进一步研究表面siRNAs可以通过DNA载体在宿主细胞内表达,这为实现基因长期沉默和诱导沉默提供了方法。质粒DNA还可以被复制,提供无限的siRNAs来源。另外,这些基于载体的RNAi和病毒递送系统结合能在许多细胞系中进行基因敲低。最近的内源microRNAs(miRNAs)研究表明合成miRNA模拟物就能够诱导RNAi通路而不需要直接使用21bp siRNA序列。这些合成的MiRNA,又被称为短发卡RNAs,pol II或Pol III启动子表达。发卡结构被Dicer酶识别剪切,形成siRNAs,随后掺入RISC,用于目标基因沉默。


Process Diagram
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in its entirety

图1.shRNA和siRNAs介导的基因沉默。 细胞能够直接被MISSION® shRNA质粒转染,实现瞬时或稳定的基因沉默。shRNA慢病毒颗粒也可用于传导目的细胞系。按照细胞核内shRNA转录过程,发卡结构被Dicer酶切割,进入RNAi通路形成siRNA。siRNA被RISC识别,介导目标mRNA基因沉默。当合成的siRNAs掺入RISC,它能够直接转染并进入RNAi通路。

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讨论


鉴于RNAi方法不断扩展,现在对于最复杂的系统研究都有了可用的手段。直到最近,合成siRNAs作为RNAi的载体对于各种应用和系统来说都是最常用的手段。商家提供设计和生产好的合成siRNAs,对于消费者来说几乎不需要再进行任何操作。只要系统易于转染(比如标准转化细胞系),这种形式的siRNAs对于任何规模的研究都是适用的。使用合成siRNAs的难点在于资源无法重复利用,诱导的基因沉默是瞬时的,并且不容易转染初级细胞和非分裂的细胞系,比如神经,淋巴细胞和巨噬细胞。另外,使用合成siRNAs进行体内敲低研究也很困难。

图2.pLKO.1-puro载体


pLKO.1-puro Vector

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鉴于RNAi方法不断扩展,现在对于最复杂的系统研究都有了可用的手段。直到最近,合成siRNAs作为RNAi的载体对于各种应用和系统来说都是最常用的手段。商家提供设计和生产好的合成siRNAs,对于消费者来说几乎不需要再进行任何操作。只要系统易于转染(比如标准转化细胞系),这种形式的siRNAs对于任何规模的研究都是适用的。使用合成siRNAs的难点在于资源无法重复利用,诱导的基因沉默是瞬时的,并且不容易转染初级细胞和非分裂的细胞系,比如神经,淋巴细胞和巨噬细胞。另外,使用合成siRNAs进行体内敲低研究也很困难。

 

为了进一步发展和传播RNAi研究工具,Sigma-Aldrich在2005年3月加入并且赞助了RNAi联盟(TRC)。许多研究机构,知名科学家和他们的实验室组成了TRC这一研究合作组织,这些实验室分别来自哈弗医学院、麻省理工、怀特海研究所、丹娜法伯癌症研究院、麻省总医院、华盛顿大学和哥伦比亚大学。除了Sigma-Aldrich,其他一流生命科学研究机构也进行了赞助。研究所和TRC的目标是创造适用于基因医疗的多功能工具,使它们能被全球科学家共享,并且促进这些工具在疾病研究中的使用。在未来三年时间内,联盟的目标是建立全面的RNAi试剂库(载体shRNA克隆),可用于人和大鼠基因敲低表达,以此协助科学家弄清楚正常机体和疾病中的基因功能。

 

作为科研工作者的合作者和商业伙伴,Sigma-Aldrich协助研发,生产和在全球范围内推广TRC人和大鼠慢病毒是shRNA文库(MISSION® shRNA)。这一文库是由MIT和哈佛的研究机构共同设计和研发,目前包含了15,000 注释人类基因的150,000 克隆(MISSION TRC-Hs1.0)和15,000注释大鼠基因。目前我们能提供针对7,100人类基因和2,900大鼠基因的50,000克隆。该文库还包含了一系列基因家族、功能簇和药物靶标。

 

MISSION® shRNA构型使用专利的算法,根据核苷酸序列和目标基因位置关系以及序列特异性三项对序列敲低内源基因的有效性进行打分。使用BLAST进行打分,最大程度降低脱靶效应。一次最多五条shRNA序列被克隆加入pLKO.1-puro(图2),因此对目标基因覆盖面广,敲低程度有差异。(图3A 图3B)发卡结构包括了分子内20-21bp的茎和6bp的环结构,能够被Dicer识别切割,并且在宿主细胞内由U6(pol III)启动子表达。获得的siRNA复合体掺入RISC,进一步作用于RNAi通路。嘌呤霉素抗性标记是哺乳动物细胞中的稳定性筛选标记,而在大肠杆菌质粒增殖中用氨苄青霉素抗性作为标记。

 

该构型可用于瞬时或稳定的哺乳动物转染。另外,pLKO.1-puro的一些特性使得慢病毒颗粒能够感染多种细胞。5’长末端重复(LTR)、SIN/LTR (3’ LTR)和Psi包装信号允许病毒包装使用2-质粒或3-质粒慢病毒包装系统。5 使用这种多质粒方法,获得的病毒颗粒无法进行复制并且无法增殖,使得病毒颗粒的使用更为安全。6, 7另外,3’ LTR (SIN/LTR) U3区的某个缺失不影响病毒基因组包装过程中的传代,但是一旦病毒LRT转入目标细胞,就会丧失转录功能。这一特性降低了病毒颗粒复制发生的危险,避免了启动子干扰的相关问题。更为重要的是,U6启动子和shRNA组合区域能在目标细胞系内稳定表达。

使用MISSION® shRNA构型使MAPK-1沉默

图3. AMAPK 1基因沉默。 人促分裂素原活化蛋白激酶1((MAPK1, NM_138957) MISSION® shRNA集(5个单独发卡结构)被用来在包装细胞中产生慢病毒颗粒。HEK 293T细胞被含有shRNA序列的慢病毒颗粒感染。感染后72和144小时提取纯化总RNA,并用适合的TaqMan™基因表达检测试剂盒分析。使用感染样本和未感染对照细胞的Ct差异和PCR效率计算表达水平百分比。百分数是与对照水平进行比较后得到的(100%)。

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使用MISSION® shRNA构型使JAK-1沉默

图3B. JAK 1基因沉默。 人酪氨酸激酶1 (JAK 1, NM_002227) MISSION® shRNA集(4个单独发卡结构)被用来产生慢病毒颗粒,并且感染HEK 293T细胞,方法如上。按上述方法分析感染后72和144小时的总RNA。结果表明,与对照水平相比,shRNA构型导致了JAK1基因沉默。

总结


RNAi技术是近十来年生物领域一项突破性进展,革新了基础生物、基因功能等方面的研究。该技术或许还将在药物发现和治疗领域引发重大变革。合成siRNAs还为原本难以触及的原核生物系统研究提供了所需的遗传学工具。然而,随着研究系统复杂度的不断变化,许多困难被发现。

 

MISSION® 预克隆shRNAs克服了这些问题。它提供的系统能够实现长期稳定基因沉默、表型观察、无限增殖质粒,可选择瞬时或稳定转染,能够产生用于感染的慢病毒,能够结合到基础细胞,分离细胞和非分裂细胞中去。Sigma-Aldrich致力为您的RNAi研究提供无与伦比的产品和服务。

致谢


特别感谢研发副总裁David Smoller,Sigma-Aldrich功能基因组研发组。Amy Malterer、Renee Girault、David Cutter和Andrea Spencer协助病毒颗粒生产和敲低实验,感谢博德研究所David Root和他的同事们,感谢华盛顿大学Sheila Stewart和TRC所有为本文提供科学建议和协助的研究者们。

MISSION® 为Sigma-Aldrich Co的注册商标。LLC标签许可证

RNAi联盟shRNA文库在麻省理工授权许可下产生和发布。

 

参考文献


  1. Fire, A., et al., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391, 806-811 (1998).
  2. Napoli, C., et al., Introduction of a chimeric chalcone synthase gene in petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell, 2, 279-289 (1990).
  3. Hannon, G.J., RNA Interference. Nature, 418, 244-251 (2002).
  4. Elbashir, S.M., et al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature, 411, 494-498 (2001).
  5. Stewart, S.A., et al., Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA, 9, 493-501 (2003).
  6. Zufferey, R., et al., Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat. Biotechnol. 15, 871-885 (1997).
  7. Zufferey R., et al., Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol., 72, 9873-9880 (1998).

 


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有关文库、定价和询价的问题及其他方面问题,请通过电子邮件联系我们:MISSIONRNAi@sial.com.



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