功能基因组学&RNAi

MISSION®慢病毒对照

在进行shRNA实验时,合适的对照是实验设计的关键要素。对照的合理使用可以准确的解释敲低结果,并保证观察到的表型特异性。Sigma可提供多种阳性、阴性和转导对照来满足这些需求。所有的对照都能够以纯化的质粒DNA和慢病毒颗粒两种形式提供。DNA形式的对照可直接用于基于转染的实验,或者与MISSION®慢病毒包装混合物(SHP001)一起使用,产生无复制能力的病毒颗粒来用于基于转导的实验。另外,我们最受欢迎的对照现在可提供高滴度的“现货供应”模式。这些对照以慢病毒的形式提供,最低滴度为109 TU / ml(经p24检测)。所有其它对照以及任何的MISSION®TRC shRNA,都可以通过我们的 慢病毒定制生产流程以提供高滴度规格。

MISSION®研发团队与 RNAi联盟(TRC)的科学家合作,生产了一系列的对照,来确保您的shRNA实验成功实施。基础载体TRC1.5-pLKO.1-puro作为TRC的一部分,由Broad研究所研发。 TRC1.5为默克生命科学独有,包含近200,000个克隆,其中超过49,000个克隆经过验证。它不仅包含了TRC1的所有内容,还加入了另外的39,212个克隆——这些克隆靶向2661个新的人类基因和2395个小鼠基因。TRC1.5克隆与TRC1克隆具有完全相同的载体骨架。

Sigma-Aldrich既是TRC1.5和TRC2的协作成员,也是其供应商。TRC2载体略有不同,TRC1.5载体和TRC2载体之间的唯一变化是添加了WPRE(土拨鼠肝炎转录后调控元件)。2由于有两个载体骨架,因而我们提供了两组对照以获得最佳的实验结果。

组成型表达的shRNA对于大多数RNA干扰是有用的,但进一步表征通常需要有调节基因表达的能力。 在研究必需基因和致死基因时,调控表达尤为重要。Sigma能够提供  IPTG诱导型shRNA载体,这是我们与TRC持续合作的最新研究进展。

 

TRC1.5 shRNA对照

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TRC1.5对照说明书

注:所有对照的载体图谱都可在shRNA载体图谱页面找到。

TRC1.5阴性对照

未处理的细胞

对于任何一个好的实验来说,第一个阴性对照建议是未经处理的细胞。未经处理的细胞将提供一个与所有其它样品相比较所用的参考点。 

空载体对照(SHC001SHC001VSHC001H)

空载体TRC1.5-pLKO.1-puro是一种有用的阴性对照,它不含shRNA插入片段,不会激活RNAi通路。它将观察转染过程或慢病毒载体的递送给细胞带来的影响。用空载体转染的细胞为特定敲减的比较提供了有用的参考点。

非靶向shRNA对照(SHC002SHC002VSHC002HSHC016SHC016VSHC016H)

这些非靶向shRNA载体是有用的阴性对照,它们可以激活RISC和RNAi通路,但不靶向任何人或小鼠基因。非哺乳动物的非靶向对照已被发现靶向一部分tGFP。如果您正在进行tGFP表达细胞系的实验,您应该考虑购买我们最新的非靶向shRNA对照,该对照已经通过生物信息学方法确定,不针对任何物种中的任何基因。可用来检查shRNA转导和RNAi激活对基因表达的影响。用非靶向shRNA载体转染的细胞也将为敲减的解释提供有用的参考。

TurboGFP shRNA (SHC004SHC004VSHC004H),eGFP shRNA (SHC005SHC005V)和荧光素酶shRNA (SHC007SHC007V)

因为这些shRNA不靶向任何已知的人或小鼠基因,所以它们可以在许多shRNA实验中作为非靶向对照。

TRC1.5转导/转染阳性对照

Sigma目前为TRC1.5-pLKO.1-puro骨架提供各种各样的带有荧光报告基因的对照。此外,我们提供两个荧光报告基因的对照,它们用交替启动子来驱动荧光基团和泛素C(UbC)。下面的表格和图片显示了Sigma荧光蛋白对照中使用的荧光蛋白的激发和发射波长。

荧光蛋白的激发和发射波长

 

货号 荧光基团 激发波长 发射波长
SHC003 / SHC014 TurboGFP 482 502
SHC010 TagCFP 458 480
SHC011 TagYFP 508 524
SHC012 TagRFP 555 584
SHC013 / SHC015 TagFP635 588 635

TurboGFP对照载体(SHC003SHC003VSHC003H)

该载体是测量转染效率和优化shRNA递送效果的有用对照。TurboGFP TM对照载体由慢病毒骨架载体pLKO.1-puro组成,含有编码TurboGFP的基因,由CMV启动子驱动。该载体的转染提供了成功转染和递送的快速可视化确认。

转导后48小时表达TurboGFP的细胞。慢病毒滴度经基于p24的ELISA估计为1.0 x 106 TU/ml。

TagCFP对照载体(SHC010SHC010V)

该载体是测量转导效率和优化shRNA递送效果的有用对照。TagCFP™对照载体由慢病毒骨架载体pLKO.1-puro组成,含有编码TagCFP的基因,由CMV启动子驱动。该对照载体提供了成功转导的可视化确认。

 

MOI为5时,转导后6天表达TagCFP的细胞。

TagYFP对照载体(SHC011SHC011V)

该载体是测量转导效率和优化shRNA递送效果的有用对照。TagYFP™对照载体由慢病毒骨架载体pLKO.1-puro组成,含有编码TagYFP的基因,由CMV启动子驱动。该对照载体提供了成功转导的可视化确认。

MOI为5时,转导后6天表达TagYFP的细胞。

TagRFP 对照载体(SHC012SHC012V)

该载体是测量转导效率和优化shRNA递送效果的有用对照。TagRFP™对照载体由慢病毒骨架载体pLKO.1-puro组成,含有编码TagRFP的基因,由CMV启动子驱动。该对照载体提供了成功转导的可视化确认。

MOI为5时,转导后6天表达TagRFP的细胞。

TagFP635 对照载体(SHC013SHC013V)

该载体是测量转导效率和优化shRNA递送效果的有用对照。TagFP635™对照载体由慢病毒骨架载体pLKO.1-puro组成,含有编码TagFP635的基因,由CMV启动子驱动。该对照载体提供了成功转导的可视化确认。

MOI为5时,转导后6天表达TagFP635的细胞。

UbC-TurboGFP对照载体 (SHC014SHC014V)

该载体是测量转导效率和优化shRNA递送效果的有用对照。TurboGFP TM对照载体由慢病毒骨架载体pLKO.1-puro组成,含有编码TurboGFP的基因,由UbC启动子驱动。该对照载体提供了成功转导的可视化确认。

MOI为5时,转导后6天表达UbC-TurboGFP的细胞。

 

UbC-TagFP635对照载体 (SHC015SHC015V)

该载体是测量转导效率和优化shRNA递送效果的有用对照。TagFP635™对照载体由慢病毒骨架载体pLKO.1-puro组成,含有编码TagFP635的基因,由UbC启动子驱动。该对照载体提供了成功转导的可视化确认。

MOI为5时,转导后6天表达UbC-TagFP635的细胞。

 

TRC1.5敲减阳性对照

TurboGFP shRNA (SHC004SHC004VSHC004H)

TurboGFP shRNA载体由TRC1.5-pLKO.1-puro载体组成,含有靶向TurboGFP的shRNA,可以用作快速的可视化敲减效果的阳性对照。经实验证实,该TurboGFP shRNA对照在24小时后将HEK293T细胞中的GFP表达减少了99.6%。

eGFP shRNA载体由TRC1.5-pLKO.1-puro载体组成,含有靶向eGFP(GenBank登记号pEGFP U55761)的shRNA,可以用作快速的可视化敲减效果的阳性对照。

 

eGFP shRNA (SHC005SHC005V)

eGFP shRNA载体由TRC1.5-pLKO.1-puro载体组成,含有靶向eGFP(GenBank登记号pEGFP U55761)的shRNA,可以用作快速的可视化敲减效果的阳性对照。

eGFP shRNA在HEK293T细胞中的敲减效率。图片为转染后48小时。A)单独转染100ng的eGFP表达质粒。 B)转染100ng eGFP质粒+ 200ng MISSION eGFP shRNA对照载体。 C)明场照片。

荧光素酶shRNA (SHC007SHC007V)
MISSION荧光素酶shRNA载体由TRC1.5-pLKO.1-puro载体组成,含有靶向萤光素酶(来自北美萤火虫,GenBank登记号M15077)的shRNA插入片段。该对照可以作为快速确认敲减的阳性对照。

 

Human Positive Control #1, B2M shRNA (SHC008SHC008V)

人类阳性对照1号, B2M shRNA (SHC008SHC008V)

B2M是一种广泛表达的基因,在大多数细胞表面都发现了该蛋白。该对照提供了清楚和可测量的人类基因靶标的敲低,在人上皮肺癌细胞系A549细胞中敲减通常为80-90%。在我们的实验中,MOI为3,在转导后1天将细胞置于嘌呤霉素中筛选并继续生长1-2周。之后用B2M特异性引物探针组进行RNA分析。蛋白质印迹数据也显示了该对照的敲减效果。

 

Human Positive Control #2, ARHGDIA shRNA (SHC009, SHC009V)

人类阳性对照2号,ARHGDIA shRNA(SHC009, SHC009V)

该对照提供了清楚和可测量的人类基因靶标的敲低,在人上皮肺癌细胞系A549细胞中敲减通常为80-90%。Rho GDP解离抑制剂(GDI)α(ARHGDIA)是一种广泛表达的基因,在大多数细胞的细胞内发现了该蛋白质。

 

用空载体对照SHC001V或人类阳性对照2号SHC009V转导A549细胞。之后制备细胞裂解液。在通过超支化PCR确定mRNA水平已经耗尽后,使用抗ARGHDIA抗体R3025,通过蛋白质印迹检测蛋白质水平。观察到蛋白质几乎被完全消除。

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TRC2 shRNA对照

TRC2对照说明书

注:所有对照的载体图谱都可在 shRNA载体图谱页面找到。

TRC2阴性对照

未处理的细胞

对于任何一个好的实验来说,第一个阴性对照建议是未经处理的细胞。未经处理的细胞将提供一个与所有其它样品相比较所用的参考点。

 

空载体对照(SHC201SHC201V)

空载体TRC2-pLKO.1-puro是一种有用的阴性对照,它不含shRNA插入片段,不会激活RNAi通路。它将观察转染过程或慢病毒载体的递送给细胞带来的影响。用空载体转染的细胞为特定敲减的比较提供了有用的参考点。

 

非靶向shRNA对照(SHC202SHC202VSHC216SHC216V)

这些非靶向shRNA载体是有用的阴性对照,它们可以激活RISC和RNAi通路,但不靶向任何人或小鼠基因。非哺乳动物的非靶向对照已被发现靶向一部分tGFP。如果您正在进行tGFP表达细胞系的实验,您应该考虑购买我们最新的非靶向shRNA对照,该对照已经通过生物信息学方法确定,不针对任何物种中的任何基因。可用来检查shRNA转导和RNAi激活对基因表达的影响。用非靶向shRNA载体转染的细胞也将为敲减的解释提供有用的参考。

 

TurboGFP shRNA (SHC204SHC204V)

因为这些针对TurboGFP 的shRNA不靶向任何已知的人或小鼠基因,所以它们可以在许多shRNA实验中作为非靶向对照。

  TRC2转导/转染阳性对照

TurboGFP对照载体(SHC203SHC203V)

该载体是测量转染效率和优化shRNA递送效果的有用对照。TurboGFP TM对照载体由慢病毒骨架载体TRC2-pLKO-puro组成,含有编码TurboGFP的基因,由CMV启动子驱动。该载体的转染提供了成功转染和递送的快速可视化确认。

 

TRC2敲减阳性对照

TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

TurboGFP shRNA载体由TRC2-pLKO–puro载体组成,含有靶向TurboGFP的shRNA,可以用作快速的可视化敲减效果的阳性对照。经实验证实,该TurboGFP shRNA对照在24小时后将HEK293T细胞中的GFP表达减少了99.6%。

 

诱导型shRNA对照

 

诱导型shRNA对照说明书

注:所有对照的载体图谱都可在 shRNA载体图谱页找到。

诱导型shRNA阴性对照

未处理的细胞

对于任何一个好的实验来说,第一个阴性对照建议是未经处理的细胞。未经处理的细胞将提供一个与所有其它样品相比较所用的参考点。

 

诱导型非靶向shRNA对照(SHC312SHC312VSHC332SHC332V)

这些MISSION非靶向诱导型shRNA载体是有用的阴性对照,它们可以激活RISC和RNAi通路,但不靶向任何物种中的任何已知基因。可用来检查shRNA转导和RNAi激活对基因表达的影响。用非靶向诱导型shRNA载体转染的细胞也将为敲减的解释提供有用的参考。

 

诱导型TurboGFP shRNA (SHC314SHC314VSHC334SHC334V)和荧光素酶shRNA (SHC317SHC317VSHC337SHC337V)

因为这些诱导型shRNA不靶向任何已知的人或小鼠基因,所以它们可以在许多可诱导shRNA实验中作为非靶向对照。

 

 诱导型shRNA敲减阳性对照

诱导型TurboGFP shRNA (SHC314SHC314VSHC334SHC334V)

MISSION诱导型TurboGFP shRNA 载体由pLKO.5-puro载体组成,含有靶向TurboGFP的shRNA,可以用作快速的可视化敲减效果的阳性对照。经实验证实,该TurboGFP shRNA对照在24小时后将HEK293T细胞中的GFP表达减少了99.6%。

 

诱导型荧光素酶shRNA (SHC317SHC317VSHC337SHC337V)

MISSION诱导型荧光素酶shRNA载体由pLKO.5-puro载体组成,含有靶向萤光素酶(来自北美萤火虫,GenBank登记号M15077)的shRNA插入片段。该对照可以作为快速确认敲减的阳性对照。

 

MISSION是Sigma-Aldrich Co. LLC的注册商标

TurboGFP,TagCFP,TagYFP,TagRFP,TagFP635是Evrogen的商标。

 

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