MISSION®siRNA

实验设计常见问题解答

你们是否提供使用N-TER进行siRNA反向转染的简单方法?
是的,请参阅我们网站提供的方案 http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Brochure/nter_sirna_nanoparticles.pdf.

 

将siRNA整合到基因组中可以得到稳定敲除细胞系?
不可以,siRNA不能整合到基因组中。若您需要稳定的“敲低”细胞系,请参阅shRNA产品系列。

 

siRNA沉默基因多长时间?
通常于转染后24小时评估由siRNA产生的基因沉默。沉默效果可持续5-7天。但基因敲低的持续时间和水平取决于细胞类型和siRNA的浓度。为保持基因敲低可重复转染。

 

如何提高siRNA的效果?
文献表明向siRNA实验中添加依诺沙星可提高siRNA敲低靶基因的能力。更多相关信息请参阅下文。
*Shan, G., et al., A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing. Nature Biotechnology 26: 933-40 (2008).

 

另一篇可能有用的参考文献是: Duxburya, M.S., et al., RNA interference: A mammalian SID-1 homologue enhances siRNA uptake and gene silencing efficacy in human cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 331(2): 459-463 (2005). 
你们提供混合siRNA吗?
是的,有两种不同的格式。

混合siRNA包含双链体各5纳摩尔,可由预先设计和定制的siRNA双链体组成。更多信息请参阅: sigma.com/missionsirna

MISSION esiRNA或内切核糖核酸酶处理的siRNA是由大肠杆菌RNA酶III切割长双链RNA(dsRNA)产生的混合siRNA寡聚物。由于MISSION esiRNAs是所有靶向相同mRNA序列的混合siRNA,它们具有高度特异性。esiRNA的份量有0.1纳摩尔,0.25纳摩尔,2纳摩尔或5纳摩尔。

更多信息请参阅:sigma.com/esirna 
 
你们有推荐的步骤来混合单个订购的双链吗?
是的。按照以下步骤,将要混合的每个siRNA双链去掉一半的数量。

  1. 用100微升的分子生物学级水(货号W4502)复溶每个双链(不需要缓冲液,它已经包含在干物质中)
  2. 从各个组分siRNA中吸取50微升转移至新的试管中。
  3. 每个试管中剩余的siRNA溶液可用于进一步评估或附加实验。建议储存温度为-20°C。
制备siRNA原液的浓度应为多少?
我们推荐的原液浓度为50-100 µM。

 

我可以用不含核糖核酸酶的水而不是1x TE缓冲液复溶干燥的siRNA双链沉淀吗?
事实上我们并不推荐在1x TE缓冲液中复溶干燥的siRNA。

 

重建干燥的siRNA之前,略微转动试管。 siRNA在缓冲液(如下)存在的情况下干燥,所以用分子生物学级水(不含DNA酶和RNA酶)复溶siRNAs,Sigma-Aldrich货号W4502。
siRNA缓冲液:
醋酸钾(100 mM)
HEPES (30 mM)
醋酸镁(2mM)

 

注意:siRNA在实验过程中易被核酸酶降解。请使用不含核糖核酸酶的试剂、试管和过滤/屏障移液器吸头。操作siRNA产品时必须戴手套。

 

我如何计算样本中siRNA的浓度?
通过使用双光束分光光度计在260 nm (A260)测量其吸光度来最准确地量化RNA。
使用Beer定律: A260 = (e)(C)(L)
e= 消光系数(质保文件提供)
C = siRNA 浓度
L = 比色皿长度
重悬siRNA的最终浓度可通过求解C并乘以稀释因子来计算。

 

如何将nmol转换为ug?
质保文件中的分子量乘以摩尔数。

 

例如,若您收到10 nm尔的siRNA,并且该siRNA的分子量是13,300,计算如下:
(10 nmol)(13,300 g/mol)(mol/10^9 nmol)(10^6 µg/g) = 133 µg

 

OD与nmol和ug存在何种关系?
siRNA是双链RNA:
1 A260 unit = 60 ug dsRNA
1 OD siRNA duplex = 5 nmol = 60 ug

 

不同的板/孔应使用多少siRNA?将2 OD (10 nmol) siRNA转染6孔板需要多少孔?
请参阅表格中推荐的试剂量。注意: siRNA终浓度= = 30nM 1 nmol = 1000 pmol
 
典型siRNA实验试剂用量
格式 转染试剂(µL) siRNA (pmol) 细胞/孔 总体积(mL)
96 孔 0.3-1 3 6000 0.1
24 孔 1-3 15 40000 0.5
12 孔 2-4 30 80000 1.0
6 孔 3-6 75 200000 2.5
第二个问题解答,您可以转染约10000/75 =〜130孔

 

开始新的实验时应使用哪一siRNA浓度?
我们建议预试找出每种细胞类型和新的实验步骤的最佳siRNA浓度,在培养基中使用浓度范围为5 nM- 100 nM的MISSION siRNA。我们发现30 nM通常是合理的起始siRNA浓度。理想情况下,应使用敲低试剂的最低浓度。这也有助于减少潜在的脱靶效应。

 

如果我的细胞过度表达某个基因,针对该基因的siRNA可否将其敲低?
大量实例表明过度表达的基因可使用siRNA成功敲低。
尽管siRNA可能吞噬一些正在产生的信息,但很难说清具体效果是什么。您可能需要平衡最终的siRNA浓度与毒性/细胞先天免疫应答,以查看功能性敲低。
我想敲低的基因非常稳定。这将怎样影响我的siRNA实验?
即使稳定的基因,如常见的管家基因GAPDH和亲环蛋白B,也可使用典型的siRNA方法有效沉默。细胞活力分析往往是很好的控制操作,且在尝试沉默可能是最稳定表达的潜在必需基因时更加重要。

 

MISSION siRNA在敲低高表达,稳定的信息方面非常有效。即使该基因的蛋白质相当稳定,使用siRNA时mRNA的稳定性不会产生很大的困扰。RNA干扰过程直接靶向mRNA转录物进行切割,并由细胞核酸酶降解。根据您的目标信息优化siRNA的用量,以便经验性检测。
从异质群体(混合siRNA)中分析单个siRNA序列的最佳策略是什么?
若您购买了混合的合成siRNA,而不是由自己混合单个siRNA,最好的方法是将混合物中包含的siRNA单个订购并检测。我们的siRNA以合适的浓度单个出售,用于混合和单个检测。

 

如何转染悬浮细胞?
Sigma-Aldrich 不提供适用于悬浮细胞的转染试剂。市场上有几种转染试剂可用于悬浮细胞。

 

您是否有siRNA转染的方案和/或推荐的试剂?

我们没有提供siRNA转染的方案。因为这完全取决于您选择的转染试剂。但我们提供两种siRNA转染试剂。MISSION® siRNA转染试剂S1452用于瞬时敲低真核生物基因表达和 N-TER™纳米颗粒siRNA转染系统N2913。 N-TER只适用于贴壁细胞,不适用于悬浮细胞系。但在某些情况下,若细胞系被加压或分化并且细胞开始粘附,则N-TER可以起作用。该现象已在U937细胞中观察到。这些细胞在悬浮液中不能用N-TER转染,但如果它们受到应激并开始粘附,则可以用N-TER转染。

两种转染试剂在产品订购页面上都有技术公告说明转染siRNA的过程。

I如果您正在使用其他转染试剂,请参阅供应商的技术公告方案

如何优化我的细胞系转染条件?
为确定特定细胞系的最佳转染条件,我们建议设置一个细胞密度和siRNA浓度矩阵。使用经验证的高效siRNA优化是个好办法。若适合该细胞系,也应测试血清与无血清的矩阵。无论细胞类型如何,N-TER / siRNA复合物都能快速进入细胞,因此不需长时间孵育细胞。无论是永生还是原代,大多数贴壁细胞系都可以用N-TER转染。
我应该使用哪些细胞进行siRNA实验?
通常根据研究的功能类型来选择细胞系。例如,研究肝功能通常使用HepG2或类似的细胞系,因为这些细胞系来源于肝细胞。

 

哪些细胞系经过你们的siRNA实验测试?
我们的大多数研究采用HeLa和A549细胞系进行,因为这两种细胞系在整个学术界很常用。
 
我应该使用什么阴性对照?
我们还提供MISSION siRNA通用阴性对照,货号为SIC001和SIC002,适用于一般siRNA。这些对照的包装份量是1 nmol或5 x 1 nmol。我们也可以根据客户要求合成对照。许多客户有他们偏好的乱序对照,另一些客户使用荧光素酶或eGFP siRNA对照。这些可以从“定制产品”的定制siRNA进行订购。
萤光素酶(或其他标记基因)的优点是,当与相应的标记基因共转染时,可将这些siRNA用作阳性对照。
 
您推荐什么siRNA对照?
我们提供了几个人和鼠的阳性对照。请访问我们的阳性对照网页 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/mission-positive.html. 阳性对照份量同我们的标准siRNA份量10 nmol,25 nmol或50 nmol。
我们还提供MISSION siRNA通用阴性对照,货号为SIC001和SIC002,适用于一般siRNA。这些对照的包装份量是1 nmol或5 x 1 nmol。
我们也可以根据客户要求定制合成阳性或阴性对照。许多客户有他们偏好的乱序对照,另一些客户使用荧光素酶或eGFP siRNA对照。这些可以从“定制产品”的定制siRNA进行订购。
萤光素酶(或其他标记基因)的优点是,当与相应的标记基因共转染时,也可以将这些siRNA用作阳性对照。