细胞系冻存实验方案

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 目标

本实验方案是由欧洲认证细胞培养委员会(ECACC,英格兰公共卫生部组成机构)推荐的细胞系冻存方法。该实验方案通过使用基于–80 °C冷冻电冰箱的被动方法对细胞系进行冻存。ERCC日常使用的是由Planer生产的程序控制冷冻仪(Planer Series Two)。这是一种最为可靠并可重复的细胞冻存方法,但该设备的成本会超出绝大多数研究型实验室的预算。下面将会对此方法进行详细的描述。如果日常有大量的细胞需要进行冻存,则推荐使用程序控制冷冻仪。

 

 材料

  • 冷冻培养基(通常是70%基础培养基,20% FBS,10% DMSO [货号D2650]或甘油,查看ECACC数据清单以获取详细信息)
  • 70%乙醇水溶液(货号R8382
  • 无Ca2+ Mg2+ 的PBS(货号D8537
  • 0.25% 胰蛋白酶/EDTA溶于HBSS,不含Ca2+/Mg2+ (货号T4049
  • 胰蛋白酶/EDTA(货号T4049
  • HL60(货号98070106-1v1 – ECACC)

 

 设备

  • 个人保护装置(无菌手套,实验服)
  • 完全面部保护面具/头盔
  • 37 °C水浴
  • 具有合适防污染等级的微生物安全柜
  • 离心机
  • 血球计数仪(Sigma® Bright-Line™ ,货号Z359629,改良的Neubauer-Camlab CCH.AC1)
  • 预标记的安瓿管/冻存管
  • 细胞冷冻装置(如Nalgene® Mr. Frosty ,货号 C1562

 

 操作步骤

通过倒置显微镜观察细胞的密度并却确定不存在细菌或真菌污染物。

通过使用胰蛋白酶/EDTA(货号T4049)将贴壁或半贴壁细胞制成悬浮液,并用至少胰蛋白酶相同体积的新鲜培养基进行复溶。复溶后的细胞可以直接进行使用。取少量体积的细胞(100-200uL)进行细胞计数。理想状态下细胞活性应该大于90%才能在细胞冻存后获取很好的复苏效果。将剩余的细胞悬液150g离心5分钟。

用新鲜培养基按每毫升2-4x106 的浓度将细胞复溶。取1ml的细胞液加入到已经标记好细胞名称、传代数、细胞浓度和日期的安瓿管,并将安瓿管放置在如Nalgene Mr. Frosty(货号C1562)的被动冷冻盒中。用异丙醇装满冷冻盒并置于–80 °C过夜。冷冻后的安瓿管应该被转移至液氮罐中的蒸汽环境中进行储存并记录相应的放置位置。

 

 关键点

最为常用的细胞冻存保护剂是二甲亚砜(DMSO,货号D2650),但这也并不是适合于所有的细胞系如HL60(货号98070106-1vl – ECACC),因为DMSO可能会导致细胞的分化。在类似的情况下,就应该使用其他的替代品如甘油。之前推荐过的ECACC冷冻培养基对于绝大多数的细胞类型都显示出了较好的冻存效果。另外一种常用的冷冻培养基组成是70%基础培养基,20%FBS以及10%DMSO,但这可能并不适用于所有的细胞类型。在进行细胞冻存前,请先确定冻存培养基是否适合于您的细胞(货号C6164)。有必要确保细胞的健康并处在其指数生长期,而这可通过使用未融合的细胞(细胞未达到其最大细胞密度)并在冻存前24小时更换培养基实现。

降温的速度可能会有所不同,但对于大多数细胞通常的建议是每分钟–1 °C至–3 °C。

Mr. Frosty系统的一个替代选择是Taylor Wharton被动冷冻盒,在这里安瓿管将会被放置在杜瓦瓶的颈部以浸没在液氮蒸汽中。该系统可通过不断降低安瓿管的位置而实现温度的逐渐降低。同样也存在速度可控的冷冻装置,并特别适合于日常需要将大量安瓿管进行冷冻。在没有其他任何装置的特殊情况下,安瓿管也可并装进一个绝缘性较好的盒子(如至少1cm厚的聚苯乙烯盒)中并在–80 °C放置过夜。特别需要注意确保盒子在整个冷冻过程中处于竖直状态。一旦冷冻之后,安瓿管应该被转移至液氮罐中的蒸汽环境中进行储存并记录相应的放置位置。

如果使用–80 °C冷冻仪进行冻存,请注意需要指定专门的区域用于细胞冻存,以免样本在无意中发生移动。如果这发生在了冷冻的关键过程中,细胞活性将会受到影响。

 

 问题解决建议

John Ryan 博士

Corning Incorporated, Life Sciences

Acton, MA 01720

通常在细胞复苏和接种后很快就会发现与细胞冻存相关的细胞活性问题。问题主要会存在于四个方面:

1.     在细胞的收集和处理环节。问题可能是因为细胞被过度暴露在分离试剂中;使用的冻存保护液可能存在毒性;高密度的小悬浮液在室温或过于碱性的环境中停留的时间过长。

2.     在降温(冷冻)环节。冷冻过程中降温的速度过快或者过慢,以及受到了暂时的干扰通常都会造成大量的细胞损伤进而影响细胞的活性。没有使用合适的冻存保护液或正确的浓度也会导致细胞活性问题。

3.     在低温储存环节。如果将细胞转移至冷冻仪的过程中出现了升温的情况,或者说储存温度没有稳定在合适的低温条件下,都会造成细胞活性的降低。

4.     在解冻复苏环节。解冻过程过慢或者冻存保护剂没有被正确的去除也会造成相应的问题。

这些细胞活性问题通常都可以通过使用以下技术来确定冷冻过程中的问题来源环节。收获足量的细胞并准备加入到至少四个小瓶中。然后取出部分细胞悬液样品,使其细胞数量与待放入小瓶的细胞数量相同,并立即加入至具有适量培养基的培养皿中并孵育。该份培养细胞将会被用作对照,与其余步骤产生的培养细胞进行比较。

下一步,往剩余的细胞中加入冻存保护剂并分装至三个小瓶中。其中一瓶放置在4 °C一小时。将细胞从小瓶中取出,按照刚复苏的细胞进行处理并按之前的方法加入到含有培养基的培养皿中。该份培养细胞将会与对照培养细胞进行比较以确定冻存保护剂是否存在问题。

同时,将剩余的小瓶按照正常慢速降温的过程进行处理。随后,取一瓶立即进行解冻并按之前的方法进行处理。该份培养细胞将会与对照细胞进行比较以确定在慢速降温过程中是否存在问题。

剩余的小瓶将会被转移至低温冷冻仪并储存过夜,随后同样按之前的方法进行处理。该份培养细胞将会与对照细胞进行比较以确定问题是否与低温储存条件有关。如果还有多余的细胞,可采用不同的复苏技术以确定问题是否来源于复苏过程。

通过把所有的培养细胞同原始的细胞进行比较,应该就可以确定问题出现在冻存过程中的哪一步。一旦确定之后,该指南及相应参考资料中的相关信息应该可以帮助对问题进行解决。

 

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