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通用型蛋白酶活性检测:酪蛋白底物法


 操作流程

A. 底物

蛋白酶可切割肽键。在实验室中,通常需要测量或比较蛋白酶的活性。Sigma的非特异性蛋白酶活性检测可作为一种标准的方法测定蛋白酶活性,这也是我们在进行质控时所使用的方法。该检测以酪蛋白作为底物,当用待测蛋白酶消化酪蛋白时,酪氨酸与其他氨基酸和肽段一起释放。Folin & Ciocalteus苯酚或Folin试剂可主要与游离的酪氨酸发生反应并产生蓝色的发色基团,并可利用分光光度计的吸光值进行定量和测量。酪蛋白释放的酪氨酸越多,则产生的发色基团也越多,表明蛋白酶的活性越强。检测时,将由蛋白酶活性产生的吸光值与标准曲线比较,而标准曲线则是通过将已知量的酪氨酸与F-C试剂反应产生,并将吸光值的变化与微摩尔量的酪氨酸量相关联而生成的。根据标准曲线,蛋白酶样品的活性可以以单位来确定,而单位代表的是酪蛋白每分钟释放的酪氨酸对等物的微摩尔量。

B.材料

试剂:
蛋白酶 (P4630)
三水合磷酸氢二钾 (P5504)
酪蛋白 (C7078)
三氯乙酸 (T0699)
Folin & Ciocalteu’s 苯酚试剂 (F9252)
无水碳酸钠 (S2127)
三水合醋酸钠 (S8625)
醋酸钙 (C1000)
游离碱L-酪氨酸 (T3754)

设备:
0.45 um 聚醚砜针头过滤器和进样针
Dram样品瓶或可容纳15ml溶液的聚丙烯管
分光光度计
比色皿
移液器
搅拌/加热板
搅拌棒
天平
pH 计
绘图程序

C. 试剂制备

在进行检测实验前,我们需要确保正确制备了下列试剂:

  1. 50mM磷酸钾缓冲液,pH7.5。制备时在纯化水中加入11.4 mg/ml的三水合磷酸氢二钾,并用1M HCl调节pH。使用前将此溶液置于37°C。
  2. 通过混合6.5mg/ml的50mM磷酸钾缓冲液制备重量/体积比为0.65%的酪蛋白溶液。 在温和搅拌下将溶液温度逐渐升高至80-85℃并维持约10分钟,直至达到均匀分散。务必确保不发生煮沸。然后根据需要使用NaOH和HCl调节pH值。
  3. 110mM三氯乙酸溶液,通过用纯水按1:55对6.1N储液进行稀释而制备。三氯乙酸是一种强酸,应小心处理。
  4. 0.5M Folin & Ciolcaltea’s或Folin苯酚试剂,可与酪氨酸发生反应并产生直接与蛋白酶活性相关的可测量颜色变化。Folin苯酚试剂是一种酸,需小心处理。
  5. 500mM碳酸钠溶液,通过将53mg/ml的无水碳酸钠加入至纯水中而制备。
  6. 酶稀释液,由10mM醋酸钠缓冲液(含5 mM钙,pH 7.5,37°C)所组成。该溶液可用来溶解固体蛋白酶样品或稀释酶溶液。
  7. 1.1 mM L-酪氨酸标准储液。将0.2mg/ml L-酪氨酸加入至纯水中,并缓慢加热直至酪氨酸溶解。与酪蛋白一样,不要发生煮沸。待L-酪氨酸标准物冷却至室温,该溶液可进一步稀释用于制作标准曲线。

必要时,可使用酶稀释液将具有预设活性的固体蛋白酶样品溶解至0.1-0.2单位/ml。该溶液可作为进行质控的阳性对照,并作为我们将要进行酶活性计算的验证标准。

D. 设置蛋白酶检测和标准曲线

开始检测前,先找到4支容量约15ml的样品瓶,用于您需要检测的每种酶。其中一瓶将用作空白对照,另外三瓶将用于三种不同稀释度蛋白酶的活性检测。使用三种不同稀释度的溶液有助于在进行最终计算时进行相互核查。向每组的四个样品瓶中加入5ml 0.65%的酪蛋白溶液,并让它们在37℃的水浴中稳定约5分钟。然后,将不同体积的待测酶溶液加入到空白对照瓶之外的三个测试样品瓶中。旋转混合并在37℃孵育10分钟。 在这段孵育时间内蛋白酶发挥的活性和随之而来的酪氨酸释放,是我们需要对待测样品进行测量和相互比较的。

孵育10分钟后,向每管中加入5ml TCA试剂以终止反应。 然后将适量的酶溶液添加到包括空白管的每支管中,使得每管中酶溶液的最终体积为1ml。这是为了满足对酶本身吸光值的需要,同时确保每管终体积相等。现将溶液在37℃孵育30分钟。

在孵育30分钟过程中,可能需要在6个8ml Dram瓶(可用聚丙烯管替代)中配制不同浓度的酪氨酸标准稀释液。向六个样品瓶中分别添加0.05、0.10、0.20、0.40、0.50ml的1.1mM酪氨酸标准储液。不要向空白对照中添加任何的酪氨酸。不纯的测试样品因为会产生更少的颜色变化,所以可能需要较低的标准液。一旦酪氨酸标准溶液被加入后,加入适量的纯水至每个标准溶液中体积达到2ml。

孵育30分钟后,使用0.45um聚醚砜进样过滤器过滤每种测试溶液和空白对照,以去除样品中的任何不溶物。然后将2ml待测样品和空白滤液加入到容量至少8ml的4支Dram瓶中。 您也可以使用与制备标准溶液时相同类型的样品瓶。向含有标准溶液和空白对照的所有样品瓶中加入5ml碳酸钠,并立即加入1ml Folin试剂以获得最佳的效果。加入碳酸钠以调节因Folin试剂的加入而产生的任何pH下降。然后将碳酸钠加入到我们的待测样品和检测空白对照中。你会注意到这些溶液在加入碳酸钠后会变浑浊。随后,加入Folin试剂,其将主要与游离酪氨酸发生反应。然后将Dram样品瓶旋转混合并在37℃孵育30分钟。

在完成孵育之后,您应该注意到标准溶液会具有与酪氨酸添加量相关的颜色梯度;酪氨酸的最高浓度将对应最深的颜色。您也可以在我们的待测样品中注意到类似的明显颜色变化。使用0.45um聚醚砜进样过滤器将2ml这些溶液过滤到合适的比色皿中。现在我们开始进行检测,通过使用分光光度计来记录相应的吸光值。

E. 测量吸光值并计算酶活性

样品的吸光值是通过660nm波长的分光光度计进行测量的。光路设置为1cm。记录标准溶液、标准空白对照、不同待测样品和检测对照的吸光值。在完成所有数据的收集后,便能开始制作标准曲线。为了制作标准曲线,需要计算标准溶液和标准空白对照之间的差异吸光值,而这部分差异值源于标准溶液中酪氨酸含量差异。经过简单的计算,以标准品的吸光值变化作为Y轴,以5种标准溶液对应微摩尔量作为X轴,使用绘图程序进行标准曲线的绘制。

 

酪氨酸标准溶液体积 微摩尔酪氨酸
0.05 0.055
0.10 0.111
0.20 0.221
0.40 0.442
0.50 0.553

在我们输入了相应的数据后,便会生成一条最佳匹配和具有相应斜率公式的曲线。

随后,我们便可将每个待测样品与检测对照样品之间的吸光值差异值代入到斜率公式中,从而计算出在此特定蛋白酶解反应中的相应酪氨酸微摩尔值。随后,基于以下公式获取相应以单位/ml的酶活性值。
 

单位/ml酶 =    (释放的酪氨酸对等物微摩尔数) x (11)
(1) x (10) x (2)

11= 检测反应的总体积(ml)
10= 每单位的检测时间(分钟)
1= 所使用酶体积(ml)
2= 比色测量中使用的体积(ml)

取通过斜率公式获得的酪氨酸对等物微摩尔数,乘以检测反应的体积(ml),也就是11ml。随后再除以检测的时间(10分钟)、检测所使用的酶体积(变量如1ml)以及比色测量使用的体积(ml)(不同比色皿体积不同,本例为2ml)这三个数值。

酪氨酸的微摩尔数除以时间的分钟数得到的是我们测量得到的蛋白酶活性单位值。在通过引入测量相应的体积值,获取以unit位/ml为单位的酶活性值。为了测量稀释在酶稀释液中固体蛋白酶样品的活性,我们可将unit/ml的酶活性值除以用mg/ml为单位的原始检测所使用的固体浓度,获得一unit/mg的酶活性值。
 

unit/ml 固体 =        单位/ml 酶   
mg固体/ml酶

F. 总结

We've just shown you how to analyze protease activity using Sigma's non-specific protease activity assay. In addition, this assay is useful to ensure that our proteases have precisely determined activity before you receive them for your experiments. As you have seen, when doing this procedure it's paramount to remember to heat both the casein and tyrosine solutions slowly and not to boil them as boiling will cause degradation of the protein and effect results of the assay. Also, it's critical to prepare different blanks for both your standards and for each test sample that you have.

G. 参考文献

  1. Anson, M.L., (1938) J. Gen. Physiol. 22, 79-89
  2. Folin, O. and Ciocalteau, V., (1929) J. Biol. Chem. 73, 627