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碱性磷酸酶

Sigma-Aldrich提供了一系列广泛的碱性磷酸酶(ALP/ALKP)制剂,优化用于与抗体和其他蛋白质结合,适用于ELISA,Western blotting和组织化学检测。我们的BioUltra级碱性磷酸酶具有非常高的比活性,特别适用于需要高灵敏度的蛋白质标记。

 

免疫印迹

用抗FLAG抗体和ALP标记的二抗检测FLAG-BAP对照蛋白,并用BCIP / NBT底物(使用ProteoQuest 免疫印迹试剂盒(比色法),PQ0111)进行染色。

免疫组化

用单克隆抗人IgA(克隆GA-112,货号I0636)和使用SIGMAFAST™ Fast Red TR/Naphthol AS-MX片剂(货号F4523)的抗鼠IgG ALP结合物作为底物对人扁桃体福尔马林固定石蜡包埋切片进行染色. 40x.

我们的产品还可用于脱磷酸化酪蛋白和其他蛋白质。ALKP可用于DNA或RNA 5’端的脱磷酸化以防止自连。DNA或RNA在通过ALKP脱磷酸化后也可标记放射性的磷酸盐(通过T4多核苷酸激酶)。

步骤

将碱性磷酸酶与抗体及其他蛋白结合

DNA脱磷酸

蛋白脱磷酸

 

牛碱性磷酸酶

牛肠ALP是一种膜来源的二聚体糖蛋白。1-3 至少存在三种异构体,每种单体通常具有两个N-连接的和一个或多个O-连接的聚糖。2 该酶需要锌和二价镁或钙离子才能激活。4

该酶对醇、胺、焦磷酸盐和酚类的磷酸酯具有广泛的特异性,通常用于蛋白质和核酸的脱磷酸化。5-7

可提供BioUlta级的该蛋白
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KM:1.5 × 10–3 M (p-硝基苯磷酸酯), 19 × 10–3 M (磷酸烯醇式丙酮酸)

分子量,3 140–160 kDa (二聚体MW)
E2781%:7.6–10.5
等电点4,8,9 同工酶在4.4–5.8之间

最适pH:该酶最稳定的pH值范围为7.5–9.5.3 最佳酶活的pH值是8-10。最适pH值也取决于底物、底物浓度和离子浓度的变化。8本产品的酶活是在pH值为9.8时进行测定的(二乙醇胺缓冲液酶检测法)。

温度对于活性和稳定性的影响

牛碱性磷酸酶的抑制剂

螯合剂、砷酸盐、半胱氨酸、碘、无机磷酸盐、焦磷酸盐、异丙磷、磷酸三苯酯、氟磷酸二和L-苯丙氨酸。9,10

左旋咪唑(货号L9756)通常用来抑制内源性ALKP活性,而对于肠酶只有轻量的抑制作用。11,12

检测实验方案

单位定义:一个单位DEA在pH 9.8 37 °C条件下每分钟可水解1 µmole 的4-硝基苯基磷酸酯。3个单位的DEA接近等同于1个单位的甘氨酸。

 

ALP还可用于确定巴氏杀菌对牛奶和奶酪等乳制品的有效性。ALP在约 72°C至少15秒时发生变性。非极端温度条件已被证明能破坏牛奶中的大多数病原体。因此,ALP活性可以用来测量巴氏杀菌的有效性。在过去,有两种方法被用于检测巴氏杀菌后的ALP活性,第一种是通过释放并检测苯酚的Scharer检测法,而第二种方法被称为Aschaffenberg & Mullen检测,通过检测对硝基酚的释放。两种检测都呈现阴性结果则表明ALP完全失活以及大多数乳生病原体的破坏。最近,基于同样ALP活性原理也开发出了新的更灵敏的技术。

参考文献

  1. Hsu, H.H.T., et al., J. Biol. Chem., 260, 1826-1831 (1985).
  2. Neumann, H., and Lustig, A., European Journal of Biochemistry, 109, 475-480 (1980).
  3. Fosset, M., et al., Biochemistry, 13, 1783-1788 (1974).
  4. Besman, M., and Coleman, J.E., J. Biol. Chem., 260, 11190-11193 (1985).
  5. Fernley, H.N., in: The Enzymes (Boyer, P.D., ed.), Vol. IV, 3rd ed., 417-447 (1971).
  6. Morton, R. K., Biochemical Journal, 61, 232-240 (1955).
  7. Morton, R.K., Biochemical Journal, 61, 240-244 (1955).
  8. Latner, A.L., et al., Enzymologia, 40, 1-6 (1970).
  9. Lazdunski, M., et al., Canadian Journal of Chemistry, 43, 2222-2235 (1965).
  10. Harlow, E., and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY: 1988) Chapter 9, p. 349.
  11. Stagni, N., et al., Biochim. Biophys. Acta, 761, 246-251 (1983).
  12. Van Belle, H., Biochim. Biophys. Acta, 289, 158, (1972).
  13. Roger, D.M., Am. .J Public Health, 28, 1325 (1938).

 

 

大肠杆菌碱性磷酸酶

大肠杆菌碱性磷酸酶是一种非糖基化的二聚体蛋白,主要存在于大肠杆菌的壁膜间隙,并至少有三种异构体存在。该酶的激活需要锌,并由镁离子得以进一步激活。1,2,3同牛酶一样,大肠杆菌酶对于磷酸酯具有广泛的特异性。1

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KM:0.02 × 10–3 M (对硝基苯磷酸)4

分子量2 89 kDa (二聚体MW)
E2781%:7.6–10.52
等电点5 同功酶范围4.5
最适pH:8.05

 

参考文献

  1. Reid, T., and Wilson, I.: E. coli Alkaline Phosphatase,The Enzymes, 3rd Ed. Vol. 4,P. Boyer, Academic Press, NY, 373, 1971)
  2. Anderson, R., and Vallee, B., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 72, 394 (1975)
  3. Savchenko, A.; Wang, W.; Vieille, C.; Zeikus, J.G.; Methods Enzymol. 331, 298-305 (2001)
  4. Boulanger, R.R., Jr.; Kantrowitz, E.R.; J. Biol. Chem., 278, 23497-23501 (2003)
  5. Garen, A., and Levinthal, C , Biochim. Biophys. Acta, 38, 470 (1960)

 

虾碱性磷酸酶

虾ALKP是一种二聚体蛋白,通过SDS-PAGE确定其分子量大小约为58kDa。1

该虾酶比其他来源酶在较低的温度下即可发生变性,因此建议对DNA和RNA脱磷酸化时,反应后需采取热灭活。

虾碱性磷酸酶,货号P9088

DNA脱磷酸步骤