去磷酸化

1.利用小牛肠碱性磷酸酶对DNA进行去磷酸化

材料

牛肠碱性磷酸酶,催化剂编号P4978
10X CIP缓冲液(催化剂编号C3225)
1摩尔质量的氯化钠
在25摄氏度下0.5摩尔质量的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 PH7.9
0.1摩尔质量的氯化镁
0.01摩尔质量的二硫苏糖醇存储缓冲液

储存缓冲液

10毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,PH 8.2
50 毫摩尔/升 氯化钾
1毫摩尔/升 氯化镁
0.1毫摩尔/升氯化锌
50% 甘油

过程:

  1. 将DNA溶解在1X CIP缓冲液(0.5微克DNA/10微升)中。
  2. 对于5’突出的粘末端DNA加入0.1单位/皮摩尔的CIP;对于3'突出的粘末端或布路姆试剂加入1单位/皮摩尔。
  3. 在37℃孵育60分钟。
  4. 苯酚/氯仿提取物2(P3803P2069)或凝胶纯化DNA。*
  5. 乙醇沉淀法恢复DNA。2

*注意:苯酚提取物或凝胶纯化使热灭活变得不必要。
 

热灭活:对于牛肠酶,在5毫摩尔/升的乙二胺四乙酸下,加热至75℃10分钟,可使95%以上的活性失活。 注:大肠杆菌的碱性磷酸酶比牛肠酶在高温下更稳定,也更耐热灭活。

参考文献:

  1. 摩森纳,E.等人.,Z.生理学.化学.361,543.
  2. 桑布鲁克,J.等人.,分子克隆:实验手册,《冷泉港实验室》(1989年),p 5.72, 6.22-6.47 and E.3-E.13.

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2.利用虾碱性磷酸酶对DNA进行去磷酸化

虾碱性磷酸酶,催化剂编号P9088是以50%甘油溶液的形式提供的,该溶液含有25毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,pH 7.6,1毫摩尔/升的氯化镁和0.1毫摩尔/升的氯化锌. 

稀释液可以在含有5毫摩尔/升氯化镁的0.05摩尔质量三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,ph8.5中配制。 

去磷酸化反应需在0.05摩尔质量三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,5毫摩尔/升氯化镁,ph8.5中进行。 

热灭活:去磷酸化反应后,再升温至60℃15分钟即可使酶失活。

参考文献:

  1. 来自虾(北极甜虾)肝胰腺的碱性磷酸酶:一种具有催化活性亚基的二聚体酶,Comp.生物化学。生理学,99B, 755-761,1991.
  2. 萨姆布鲁克,J.,罗素,D.W.,分子克隆:《实验手册》,第3版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,2001年。
  3. Takanami,M.,核糖核酸1的5'-末端核苷酸序列,大肠杆菌核糖体RNA的5'-末端的分析。生物学.23,135(1967).

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3.利用牛肠碱性磷酸酶对蛋白进行去磷酸化

程序:

1.  孵育100个的碱性磷酸酶,催化剂。编号P0114与400微克蛋白质在5毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷pH 7.9,10毫摩尔/升氯化钠,1毫摩尔/升氯化镁,和0.1毫摩尔/升二硫苏糖醇,在30℃下放置30分钟。

2.  按照十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法,加入5倍的样品缓冲液并煮沸即可终止反应。

参考文献:

  1. 拉布格R,等,在急性心肌梗死患者血清中检测到广泛的肌钙蛋白I和T修饰。102(11):1221-1226(2000)期。

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