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木瓜蛋白酶

物理性质和动力学

木瓜蛋白酶是肽酶C1家族的一种半胱氨酸蛋白酶。它由单一多肽链组成,含有三个二硫键和一个酶活性所必需的巯基。

分子量: 23,406 Da(氨基酸序列)16
活性最适pH:6.0-7.0
活性最适温度: 65 °C22
pI: 8.75 17; 9.55 18光谱特性:
λmax: 278 nm 19
消光系数: E1% = 25 19
消光系数: EmM = 57.6 (at 280 nm) 20

每单位定义:在25 °C ,pH 6.2的条件下每分钟水解1.0 µmole N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙酯所需的酶量即为一个单位。

特异性

木瓜蛋白酶可消化大部分蛋白底物,比胰蛋白酶范围更广。木瓜蛋白酶具有广泛的特异性,可断裂基础氨基酸,亮氨酸或甘氨酸的肽键。它还能水解脂类和酰胺类化合物。木瓜蛋白酶更倾向于P2位置有大的疏水侧链的氨基酸,它不接受P1'位置的缬氨酸。1

 

应用

  • 木瓜蛋白酶广泛应用于细胞分离操作,在某些组织中已被证实比其他蛋白酶效率更高且破坏性更小。2 例如,木瓜蛋白酶可用于分离有活性的,形态完整的出生后大鼠的皮质神经元。Sigma公司的木瓜蛋白酶(货号No. P4762)可用于分离平滑肌细胞3,4,能够分离出大量的有活性的平滑肌细胞,并且不影响细胞对刺激剂的敏感性。5
  • 木瓜蛋白酶的部分水解作用可用于酶和其它蛋白质的结构研究。6-8
  • 木瓜蛋白酶可应用于红细胞血清学,它通过对红细胞表面的修饰来加强或破坏许多红细胞抗原的反应性,可作为分类、抗体筛选、抗体鉴定的辅助手段。木瓜蛋白酶在血小板血清学中也有应用。9
  • 木瓜蛋白酶也可用于氨基酸、肽链和其它分子的酶合成。10-13
  • Fab 和 F(ab')2 抗体片段可用于不能出现Fc域的实验系统。在这种情况下,只用抗原结合片段(Fab)更为合适。木瓜蛋白酶可用于常规制备免疫球蛋白G的 Fab片段。免疫球蛋白M也可被木瓜蛋白酶消化,产生大量的同种Fab片段。15
  • 木瓜蛋白酶将抗体切割为两个Fab片段(其可变区能够特异性识别抗原),和一个Fc片段。14 它的切割位置在重链之间二硫键的铰链区之上,重链和轻链中间二硫键位点之下,从而形成了两个分开的Fab片段单价体(各包含单一抗体结合位点),和一个完整的Fc片段。各个片段可用凝胶过滤、离子交换或者亲和层析法来纯化。抗体消化和抗体片段提纯方法可参见《抗体实验室手册》(E. Harlow and D. Lane, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)。
  • 在淋巴结、脾脏等组织,或是外周血制剂中,含Fc受体的细胞(如巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞等)可结合完整抗体的Fc域,导致不含目标抗原的区域也出现背景染色。Fab片段的应用确保了抗体仅结合抗原而非Fc受体。这些片段也可用于血浆存在情况下的细胞染色,因为它们不能结合可溶解细胞的补体。Fab片段的应用使得目标抗原定位更精准,例如在电子显微镜的组织染色中。

 

 

抑制剂

 
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A6191 微生物来源抗蛋白酶
C121509 98%胱氨二盐酸盐
C7268 微生物来源糜蛋白酶抑制素
C8917 鸡蛋清冻干粉来源半胱氨酸蛋白酶抑制剂
D7910 3,4-二氯异香豆素
E3132 E-64蛋白酶抑制剂
E3520 依布硒啉
G5386 Gly-Gly-Tyr-Arg ≥97% (HPLC)
L2023 微生物来源亮肽素三氟乙酸盐,≥90%(HPLC)
M6159 人血浆冻干粉来源α2巨球蛋白,≥98%(SDS-PAGE)

 

底物

 
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B4500 Nα-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐
P3169 p谷氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸对硝基苯胺
G2500 猪皮A型明胶
B7260 Nα-苯甲酰-L-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐

 

溶解度和溶液稳定性

木瓜蛋白酶以10mg / ml溶于水中。使用之前,稀释于含5 mM L-半胱氨酸的缓冲液中。它的活化/稳定剂包括EDTA、半胱氨酸和二巯基丙醇。21

木瓜蛋白酶溶液具有很好的温度稳定性,不过它的稳定性却依赖于pH。在酸性条件下,木瓜蛋白酶溶液并不稳定,例如在pH低于2.8时其活性有显著的降低。在溶解状态下,木瓜蛋白酶的活性每天约丧失1-2%,可能是自我分解和/或氧化作用所致。

在分离过程中获得的木瓜蛋白酶常见的非活性形式,是蛋白质的活性位点巯基和游离半胱氨酸之间形成的混合二硫化物。

木瓜蛋白酶溶液在几种变性剂中也保持稳定,例如经70%甲醇和8M尿素溶液再结晶之后依然保持完整活性。不过,经10%三氯乙酰或6M盐酸胍处理后木瓜蛋白酶的活性有显著地降低。

   

产品

 
货号 产品名称 添加到购物车
P3125 木瓜蛋白酶,来自木瓜乳,水溶液,2×结晶,16-40 单位/mg
P4762 木瓜蛋白酶,来自木瓜乳,冻干粉,≥10 单位/mg
P5306 木瓜蛋白酶,来自木瓜乳,冻干粉,无菌
P3375 木瓜蛋白酶,来自木瓜乳,粗粉,1.5-10 units/mg,固体
P3250 木瓜蛋白酶,来自木瓜乳,冻干粉,0.5-2 units/mg,固体
P4406 木瓜蛋白酶凝胶,来自木瓜乳,冻干粉,90-150 units/mL,凝胶

参考文献

  1. IUBMB Enzyme Nomenclature: www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/22/2.html
  2. Huettner, J.E., and Baughman, R.W., J Neurosci. , 6, 3044 (1986).
  3. Kinoshita, K., et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 285, G483-G493 (2003).
  4. Driska, S.P., et al., J. Appl. Physiol., 86, 427-435 (1999).
  5. Hasegawa, M., et al., Nippon Heikatsukin Gakkai Zasshi, 23, 35-46 (1987).
  6. Margossian, S.S., and Lowey, S., J. Mol. Biol., 74, 301-311 (1973).
  7. Margossian, S.S., and Lowey, S., J. Mol. Biol., 74, 313-330 (1973).
  8. Shiozaki, K., and Yanagida, M., Mol. Cell. Biol., 11, 6093-6102 (1991).
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  10. Xiang, H., et al., Amino Acids, 27, 101-105 (2004).
  11. Rajesh, M., et al., J. Agric. Food Chem., 51, 2461-2467 (2003).
  12. Fukuoka, T., et al., Biomacromolecules, 3, 768-774 (2002).
  13. Burton, S.G., et al., Nature Biotech., 20, 37-45 (2002).
  14. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow, E. and Lane, D.,eds., Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY, 1988) pp. 628-629.
  15. Newkirk, M.M., et al., Hybridoma, 6, 453-460 (1987).
  16. Mitchel, R. E., et al., J. Biol. Chem., 245, 3485-3492 (1970).
  17. J. Biol. Chem., 207, 533 (1954).
  18. Sluyterman, L. A., and de Graaf, M.J., Biochim. Biophys. Acta, 258, 554-561 (1972).
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  23. Klein, I.B., and Kirsch, J. F., J. Biol. Chem., 244, 5928 (1969).