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胃蛋白酶

E.C. 3.4.23.1

生理性质

胃蛋白酶是A1多肽酶家族的一员,是脊椎动物胃液之中的主要消化蛋白酶。
分子量:34,620(猪源氨基酸序列)
pI: 2.2 - 3.02; 2.2, 2.83(猪源)
λmax:278 nm4 消光系数EmM = 51.34 (猪源)

特异性

和其他内肽酶不同,胃蛋白酶仅水解肽键,不会水解非肽酰胺键或脂键。

胃蛋白酶会优先切割疏水性物质,尤其是芳香族化合物,P1和 P1'位点的化合物。如果临近肽键的位置存在含硫氨基酸(含有芳香族氨基酸),则更易水解。

切割胰岛素B链的Phe1Val、Gln4His、Glu13Ala、Ala14Leu、Leu15Tyr、Tyr16Leu、Gly23Phe、Phe24Phe和Phe25Tyr键。5

 胃蛋白酶还会优先切割苯丙氨酸和亮氨酸的羧基端,其次切割谷氨酸残基的羧基端。胃蛋白酶不会切割缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸键。6 C端羧基酰胺化可阻止胃蛋白酶引起的水解。6,7

 

 应用

胃蛋白酶常用于从抗体制备F(ab')2 片段。在部分实验中,最好仅使用抗体的抗原结合 (Fab) 部分。在此类应用中,可能需要酶促消解抗体,产生抗体的Fab或F(ab')2 片段。如要产生F(ab')2 片段,则采用胃蛋白酶消化IgG,切割靠近铰链区的重链。其会保留一个或多个连接铰链区内的重链的二硫键,因而抗体的两段Fab区域仍连接在一起,产生二价分子(含有两个抗体结合位点),及目标F(ab')2。轻链仍保持完整,附着在重链上。Fc片段被消解成小分子多肽。通过木瓜蛋白酶替代胃蛋白酶切割IgG产生Fab片段。含有连接重链的二硫键的铰链区域上方,但在连接的轻链和重链的二硫键位点下方的IgG,由木瓜蛋白酶切割。这一过程会产生两个独立的单价(含有单个抗体结合位点)Fab片段和一个完整的Fc片段。通过凝胶过滤、离子交换或者亲和层析法纯化片段。有关抗体消解、抗体片段纯化的操作方案请见《Antibodies: A Laboratory Manual》(E. Harlow and D. Lane, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988 (A2926))。

 Fab和F(ab')2 抗体片段用于Fc区域存在可能引发问题的检测体系。在淋巴结或脾脏等组织内或者外周血制剂中,存在含有FC受体的细胞(巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞)。这些FC受体可以与完整抗体的Fc区域结合,形成不含靶标抗原的区域背景染色。使用F(ab')2 或Fab片段可确保抗体结合到抗原而非Fc受体上。存在血浆时,制备染色细胞也需要这类片段,因为血浆细胞无法互补结合,导致细胞裂解。F(ab')2可远远比Fab片段更精确地定位靶标抗原,即染色组织进行电子显微镜检测。二价F(ab')2 片段可交联抗原,用于沉淀实验、细胞聚集(通过表面抗原)或花结形成实验。胃蛋白酶反应的最适pH为1.5-2.5,此时如果不是长期暴露在低pH下均不会损伤抗体。溶液储存时应调至中性pH。有关胃蛋白酶消解抗体的对照已存在报道。8

 

 对于常规蛋白质消解,建议的条件为:采用含10 mM HCl 的0.4% 胃蛋白酶溶液,在37 °C下消解30-90分子。胃蛋白酶在pH 1.0左右时对天然蛋白质具有最优的活性,但是对于部分变性蛋白质,在pH 1.5-3.5左右时具有最优活性。9,10

 

抑制剂
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P5318 胃蛋白酶A抑制剂,≥90% (HPLC)  
 

P7626 苯甲基磺酰氟≥98.5% (GC)
 底物
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H2625 适于蛋白酶底物的牛血液来源血红蛋白,底物粉末
F5255 蓝色纤维蛋白,适于低pH胃蛋白酶底物(在高pH下会有较多的空白结果)
77431 苯丙氨酰-丙氨酰-苯丙氨酰(4-硝基)-苯丙氨酸酰-缬氨酰-亮氨酸(4-吡啶甲基)酯,BioChemika, ≥98.0% (TLC)

 

动力学,溶解性和溶液稳定性

胃蛋白酶在去离子水中的溶解度为1% (10 mg/ml) ,在低温10 mM 盐酸中的溶解度为0.4% (4 mg/ml)。pH 4.4下的溶液可在-20 °C稳定保存2-3月。12 T猪胃蛋白酶的活性最适pH约为2.2。pH 1.5时,胃蛋白酶的活性约为最大活性的90%, pH 4.5时约为最大活性的35%。13溶液在pH 6-7时保持稳定。可将pH调至最高8,但这会造成胃蛋白酶不可逆地灭活。室温下,胃蛋白酶会在pH 8.5 – 11时不可逆地降解。14

 

产品

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P7000 猪胃粘膜来源胃蛋白酶,粉末,≥250 单位/mg
P6887 猪胃粘膜来源胃蛋白酶,冻干粉末,3,200-4,500 单位/mg蛋白质
P7012 Pepsin from porcine gastric mucosa, lyophilized powder, ≥2,500 units/mg protein
P7125 猪胃粘膜来源胃蛋白酶,粉末,≥400单位/mg蛋白质
P0609 猪胃粘膜来源胃蛋白酶-琼脂糖,冻干粉末,30-70单位/mg干燥固体蛋白质
P4656 猪胃液来源胃蛋白酶原,I-s级,冻干粉末,约3,000单位/mg蛋白质(在pH 2.0、25°C下活化为胃蛋白酶后)

 

参考文献

1.      Sepulveda. P., et al., Primary Structure of Porcine Pepsin. III. Amino Acid Sequence of a Cyanogen Bromide Fragment, CB2A, and the Complete Structure of Porcine Pepsin. J. Biol. Chem.250, 5082 (1975).

2.      Jonsson, M., Isoelectric Spectra of Native and Base Denatured Crystallized Swine Pepsin. Acta Chem. Scand.26, 3435-3440 (1972).

3.      Malamud, D., and Drysdale, J.W., Isoelectric Points of Proteins: A Table, Anal. Biochem., 86, 620-647 (1978).

4.      Proc. Natl. Acad. Sci.45, 915-922 (1959).

5.      IUBMB Enzyme Nomenclature: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/23/1.html

6.      Sweeney, P.J., and Walker, J.M., in Enzymes of Molecular Biology, Burrell, M.M., ed., Humana Press (Totowa, NJ: 1993), pp. 290-291.

7.      Enzymes, Dixon, M., et al., Academic Press (New York, NY: 1979), p. 262.

8.      Rea, D.W., and Ultee, M.E., A Novel Method for Controlling the Pepsin Digestion of Antibodies. J. Immunol. Meth., 157, 165-173 (1993).

9.      Arch. Biochem. Biophys.57, 163-173 (1955).

10.    J. Biol. Chem.234, 3137-3145 (1959).

11.    Knowles, J.R., et al., The pH-dependence of the Binding of Competitive Inhibitors to Pepsin. Biochem. J.113, 343-51 (1969).

12.    Rajagopalan, T.G., et al., Pepsin from Pepsinogen. Preparation and Properties. J. Biol. Chem.241, 4940 (1966).

13.    Bohak, Z.; J. Biol. Chem,. 244, 4638-4648 (1969)

14.    Ryle, A.P., The Porcine Pepsins and Pepsinogens. Methods in Enzymol.19, 316-336 (1970).