胰蛋白酶

物理性质和体内处理

胰蛋白酶
EC号:3.4.21.4
分子量: 23.3 kDa1,2 (牛和猪)
消光系数:1% = 12.9 - 15.4 (280 nm)3,4
等电点(PI):10.1 - 10.52,5(牛)

胰蛋白酶原
分子量:24 kDa5(牛)
消光系数: E1% = 14.4 (280 nm)
等电点(PI):9.32(牛)

胰蛋白酶原(胰蛋白酶的酶原形式)由胰腺的腺泡外分泌细胞产生。人胰腺可以分泌出三种亚型的胰蛋白酶原。其中阳离子和阴离子形式是主要的人亚型。只有微量的抗抑制剂的内消旋胰蛋白酶原被发现。6酶原在到达小肠腔后才会被激活。肠激酶通过从NH2末端水解六肽而将胰蛋白酶原激活为胰蛋白酶(对牛胰蛋白酶来说,在Lys6-Ile7肽键处进行水解)。牛胰蛋白酶原由229个氨基酸的单一多肽链组成,并通过六个二硫键交联。胰蛋白酶可以自动催化激活更多的胰蛋白酶原水解为胰蛋白酶。胰蛋白酶由223个氨基酸残基的单链多肽组成。这种胰蛋白酶的天然形式被称为β-胰蛋白酶。 β-胰蛋白酶(牛胰蛋白酶中,在Lys131-Ser132处被切割)的自溶导致形成由二硫桥连接的α-胰蛋白酶。胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶S1家族的成员。胰蛋白酶的活性位点氨基酸残基包括His46和Ser183.2-5

 

Trypsin In Vivo Processing (Bovine Sequence)
 

 

特异性、动力学、底物和检测方法

特异性和动力学

胰蛋白酶能够裂解赖氨酸和精氨酸氨基酸残基C端的肽链。如果酸性残基位于裂解位点的任一侧,则水解速率较慢,如果脯氨酸残基位于裂解位点的羧基侧,则不会发生裂解。

胰蛋白酶能够水解几种合成底物的酯和酰胺键:2,7,8

货号 产品名称 加入购物车
B7260 Nα-苯甲酰基-L-精氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐
B4500 Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐
B0885 Nα-苯甲酰基-L-精氨酸4-甲氧基-β-萘酰胺盐酸盐
B4750 Nα-苯甲酰基-DL-精氨酸β-萘酰胺盐酸盐
B3133 Nα-苯甲酰-L-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐≥99%(TLC),适用于胰蛋白酶底物
B4875 Nα-苯甲酰-DL-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐≥98%

其他底物

胰蛋白酶的最适pH为7-9。10


检测方法11

大多数Sigma制剂的活性由连续速率分光光度法测定,并以BAEE为单位进行表示。

单位定义:使用BAEE作为底物,一个BAEE单位,在25℃,pH 7.6条件下,每分钟能够产生0.001的ΔA253。 反应体积= 3.2 mL(1 cm光路)。

BAEE Reaction
 

 


条件

温度= 25℃,pH = 7.6,A253nm,光路= 1cm

在3.2 ml反应混合物中,终浓度为63 mM磷酸钠,0.23 mMNα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯,0.06 mM盐酸和100单位胰蛋白酶。

试剂

  1. 67 mM磷酸钠缓冲液,pH 7.6,25°C(磷酸钠(一元,无水,Sigma货号S0751),溶于100毫升去离子水中,用1 M NaOH调节至pH 7.6)。
  2. 0.25 mM Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯溶液(BAEE)(Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐(Sigma货号B4500)溶于50ml A试剂中)。
  3. 1 mM盐酸溶液(HCl)( 浓盐酸(Sigma货号258148)于50 ml去离子水中制备)
  4. 胰蛋白酶酶溶液(使用前,在预冷试剂C中制备含有500 BAEE单位/ ml的胰蛋白酶溶液)

实验步骤


将以下试剂吸入(以毫升计)到合适的石英比色皿中:

  测试组 空白
Reagent B (BAEE) 3.00 3.00


平衡至25°C。使用适当的恒温分光光度计监测A253nm直到恒定。 然后加入:

  测试组 空白
试剂 C (HCl) 0.20
试剂(酶溶液) 0.20

立即上下颠倒混匀并记录A253nm的增加约5分钟。使用测试组和空白的最大线性速率得到ΔA253nm/分钟。

计算

BAEE单位/ 毫升酶= (ΔA253nm/分钟 测试组 - ΔA253nm/分钟 空白组)(df)
(0.001) (0.20)


df =稀释因子


0.001 =在25℃下,3.2 ml反应混合物中,pH 7.6条件下,每单位胰蛋白酶A253nm /分钟的变化

0.20 =所用酶的体积(以毫升计)

Units/mg 固体= units/ml 酶
mg 固体/ ml 酶

注:

  1. 此检测步骤不适用于测定固定化胰蛋白酶
  2. 关于USP / NF程序,请参阅USP专题讨论
  3. 此检测步骤仅供参考。对于Sigma质量控制程序的最新版本,请联系我们的技术服务部门。

单位转换

1 BAEE µM Unit = 200 BAEE Units
1 TAME µM Unit = 0.27 BAEE µM Units
1 BAEE µM Unit = 3.64 TAME Units
1 TAME µM Unit = 55 BAEE A253 Units
1 BAEE A253 Unit = 0.018 TAME µM Unit
1 TAME µM Unit = 180 TAME A247 Units
1 TAME A247 Unit = 0.33 BAEE Units
1 USP Unit = 3.0 BAEE Units
1 NF Unit = 1.1 USP Units

 

抑制剂

用于抑制胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂包括:2,11

 

产品号 产品名 加入购物车
A6664 4-脒基苯基甲磺酰氟盐酸盐
A8456 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐〜97%
A6191 微生物来源的抗痛素二盐酸盐
A2221 来自人血浆冻干粉的抗凝血酶III,≥95%(SDS-PAGE)
A9141 来自牛血浆冻干粉的抗凝血酶III,200-400unit/mg蛋白质(E1%/ 280 = 6.5)
A6150 来自人血浆无盐冻干粉的α1-抗胰蛋白酶
A9024 来自人血浆无盐冻干粉的α1-抗胰蛋白酶
A1153 来自牛肺冻干粉末的抑肽酶,3-8 TIU / mg固体
B3906 来自水蛭冻干粉的Bdellin,> 0.1IU / mg蛋白(E280)
B6506 盐酸苄脒水合物≥98%
D0879 氟磷酸二异丙酯
D7910 3,4-二氯异香豆素
G2417 甲磺酸加贝酯固体
L2023 亮抑酶肽三氟乙酸盐≥90%(HPLC),微生物
M6159 来自人血浆冻干粉的α2-巨球蛋白,≥98%(SDS-PAGE)
P7626 苯基甲磺酰氟≥98.5%(GC)
T7254 Nα-甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐≥96%(TLC)粉末
T0256 来自牛胰腺的I-P型胰蛋白酶抑制剂,基本不含盐,冻干粉末
T2011 来自鸡蛋清的III-O型胰蛋白酶抑制剂(不含卵抑制剂)
T4385 来自火鸡蛋清的II-T型胰蛋白酶抑制剂
T9003 来自大豆的I-S型胰蛋白酶抑制剂,冻干粉末
T9008 来自大豆的胰蛋白酶抑制剂(1%水溶液,不含缓冲液)
T9253 来自鸡蛋清的II-O型胰蛋白酶抑制剂,部分纯化的卵类粘蛋白,含有卵蛋白抑制剂
T9378 来自Phaseolus limensis(利马豆)的II-L型胰蛋白酶抑制剂,粗提粉末

复溶和溶液稳定性

分装并储存在-20℃的1mM HCl (pH 3)中的胰蛋白酶溶液可稳定保存约1年。Ca2+(20 mM)的存在也能够延缓胰蛋白酶自我消化的能力(自溶),并保持胰蛋白酶在溶液中的稳定性.2,9胰蛋白酶在2.0 M尿素,2.0 M盐酸胍或 0.1%(w / v)SDS仍能保持大部分活性.13胰蛋白酶在高pH(高于11)下会发生可逆变性,例如在TCA沉淀或高浓度尿素(大于6.5 M)条件下.3为了去除所有胰蛋白酶活性,需要在1%(w / v)SDS中,100°C条件下加热至少5分钟。

胰蛋白酶原溶液在酸性缓冲液(pH2-4)中较稳定,而在中性缓冲液中,胰蛋白酶易表现自催化活性。

产品

胰蛋白酶用于一般研究的应用

牛胰蛋白酶
 

货号 产品名称 加入购物车
T1426 来自牛胰腺的胰蛋白酶,基本不含盐,冻干粉,≥10,000 BAEEunit/mg蛋白质
T8003 来自牛胰腺的胰蛋白酶I型,〜10,000 BAEEunit/mg蛋白质
T1005 来自牛胰胰蛋白酶的XI型,冻干粉末,≥6,000 BAEE unit/mg蛋白质
T8658 来自牛胰腺的胰蛋白酶,适用于蛋白测序,冻干粉
T7309 来自牛胰腺的胰蛋白酶≥2,500个USP unit/mg固体,符合USP检测规范
T9935 来自牛胰腺的胰蛋白酶,基本不含盐,冻干粉末,9,000-13,000个BAEE unit/mg蛋白质,经细胞培养测试
T8802 来自牛胰腺的胰蛋白酶,基本不含盐,冻干粉,10,000-15,000 BAEE unit/mg蛋白质
T6424 来自人胰腺的胰蛋白酶,不含盐,冻干粉,每小瓶≥1000个BAEE单位


猪胰蛋白酶
 

货号 产品名称 加入购物车
T0303 来自猪胰腺胰蛋白酶IX-S型,冻干粉末,13,000-20,000 BAEEunit/mg蛋白质
T4799 来自猪胰腺胰蛋白酶,冻干粉末,1,000-1,500个BAEEunit/mg固体,经细胞培养测试
T7409 来自猪胰腺胰蛋白酶,冻干粉末,II-S型,1,000-2,000 BAEEunit/mg固体
T5266 来自猪胰腺胰蛋白酶1,000-1,500个BAEEunit/mg固体,经γ射线辐照,经细胞培养测试
T7168 猪胰腺胰蛋白酶,1毫克片剂


人胰蛋白酶

来自人胰腺的胰蛋白酶,无盐,冻干粉末,每小瓶≥1000个BAEE unit

Trypzean™ 重组牛胰蛋白酶,自玉米中表达
TrypZean粉末
TrypZean 溶液

蛋白测序
胰蛋白酶产物用于蛋白质组学/蛋白质序列分析


用于细胞解离的胰蛋白酶溶液
 

货号 产品名称 加入购物车
T4549 来自猪胰腺的胰蛋白酶溶液10×,25 g猪胰蛋白酶溶于一升0.9%氯化钠溶液中,经无菌过滤和细胞培养测试
T4674 来自猪胰腺的胰蛋白酶溶液10×,25 g猪胰蛋白酶溶于一升含有酚红的Hanks平衡盐溶液中,经无菌过滤和细胞培养测试
T4424 来自猪胰腺的胰蛋白酶溶液1×,2.5 g猪胰蛋白酶溶于一升含有酚红的Hanks平衡盐溶液中,经无菌过滤和细胞培养测试
T4049 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液,2.5 g猪胰蛋白酶和0.2 g EDTA·4Na溶于一升含有酚红的Hanks平衡盐溶液中,经无菌过滤和细胞培养测试
T3924 胰蛋白酶-EDTA溶液1 ×,0.5 g猪胰蛋白酶和0.2 g EDTA·4Na溶于一升含有酚红的Hanks平衡盐溶液中,经无菌过滤和细胞培养测试
T4299 胰蛋白酶-EDTA溶液1×,500 BAEE单位猪胰蛋白酶和180 μg EDTA·4Na 溶于1毫升不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中,经无菌过滤和细胞培养测试
T4174 胰蛋白酶-EDTA溶液10X,5.0 g猪胰蛋白酶和2 g EDTA·4Na 溶于一升0.9%氯化钠溶液中,经无菌过滤和细胞培养测试

 

 参考文献

  1. Cunningham, L. W. Jr., Molecular Kinetic properties of crystalline diisopropyl phosphoryl trypsin. J. Biol. Chem., 211, 13-19 (1954).
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  3. Keil, B., in The Enzymes, 3rd ed., Vol. III, Boyer, P. D., Academic Press (New York, NY: 1971), pp. 250-275.
  4. Shaw, E., et al., Evidence for an active center histidine in trypsin through use of a specific reagent, 1-chloro-3-tosylamido-7-amino-2-heptanone, the chloromethyl ketone derived from Nα-tosyl-L-lysine. Biochemistry, 4(10), 2219-2224 (1965).
  5. Tietze, F., Molecular kinetic properties of crystalline trypsinogen. J. Biol. Chem., 204(1), 1-11 (1953).
  6. Chen, J-M; Ferec, C., Genes, Cloned cDNAs, and Proteins of Human Trypsinogens and Pancreatitis-Associated Cationic Trypsinogen Mutations. Pancreas, 21, 57-62 (2000)
  7. Burdon, R. H., et al., in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 9, 2nd ed., Allen, G., ed., Elsevier/North (New York, NY: 1989), pp. 73-104.
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  9. Enzyme Handbook, Vol. II, Barman, T. E., Springer-Verlag (New York, NY: 1969), p. 819.
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