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胶原酶指南

 Sigma-Aldrich胶原酶产品的基本信息

胶原酶是分解天然胶原蛋白(动物组织结缔)的酶,由多种微生物和许多不同的动物细胞制造1。最有效的胶原酶是由厌氧细菌——溶组织梭菌分泌的“粗”胶原酶。由MacLennan,Mandl和Howes于1953年首先提出的发酵和纯化过程首先被Sigma-Aldrich采用,并最终被改进用于生产更高活性的产品。“粗”胶原酶是指该物质实际上是一种混合物,除胶原酶之外还有几种不同的酶,它们共同作用以分解组织。目前已知存在胶原酶的两种形式。除了少数例外,目前不同的商业胶原酶全部由溶组织梭菌制造,或者是克隆自溶组织梭菌基因的大肠杆菌表达的重组形式。

 

 Sigma-Aldrich胶原酶产品描述

下表中不同的胶原酶产品都是由Sigma-Aldrich公司研发,它们相比其他产品更好地消化了某些类型的组织(肌肉,胰腺,心脏,脂肪)。除了符合酶活性参数,许多Sigma-Aldrich胶原酶产品批次都必须通过来自大鼠不同组织的消化测试。一些描述为“经细胞培养验证”的产品,还经受了哺乳动物细胞系的附加测试,以证实它们没有细胞毒性。

一些受欢迎的胶原酶产品的0.2mm无菌过滤版也在下面列出。

Sigma-Aldrich的纯化胶原酶产品只有微量的酪蛋白酶(蛋白水解酶)或梭菌蛋白酶活性。纯化的VII型胶原酶也提供经细胞培养验证的版本和无菌过滤版本。
 

通用型粗胶原酶
 

产品 注释 FALGPAa CDUsb
C0130 通用型 0.25 – 1.0 > 125
C1639, I-S型 C0130的无菌过滤版 0.25 – 1.0 > 125
C9891, IA型 第二版通用型I型胶原酶 0.5 – 2.0 > 125
C2674, IA型 C9891的细胞培养验证版 0.5 – 2.0 > 125
C5894, IA-S型 C9891的无菌过滤版 0.5 – 2.0 > 125
C9722, IA-S型 C9891的经细胞培养验证且无菌过滤版 0.5 – 2.0 > 125

a, b FALGPA和胶原酶消化单元(CDU)均指的是单位每毫克/固体。

 

经使用测试的粗胶原酶
 

产品 注释 FALGPAa CDUsb
C6885, II型 经测试适合脂肪细胞的消化和解离,不损坏胰岛素细胞表面受体5, 6 0.5 – 2.0 > 125
C1764, II-S型 C6885的无菌过滤版 0.5 – 2.0 > 125
C5138, IV型 经测试适合有活性的大鼠肝细胞的消化和解离7 0.5 – 2.0 > 125
C1889, IV-S型 C5138的无菌过滤版 0.5 – 2.0 > 125
C2139, VIII型 通过了脂肪组织测试(参见C6885)5, 6 和肝组织测试(参见C5138)7 0.5 – 2.0 > 125
C9263, V型 经测试适合大鼠胰腺胰岛细胞(胰岛素分泌细胞)的消化和解离8, 9 1.0 – 3.0 > 125
C2014, V-S型 C9263的无菌过滤版 1.0 – 3.0 > 125
C7657, XI型 最高胶原酶活性,经测试适合大鼠胰腺胰岛细胞(胰岛素分泌细胞)的消化和解离8, 9 2.0 – 5.0 > 1,200
C9407, XI型 C7657的细胞培养验证版 2.0 – 5.0 > 1,200
C4785, XI-S型 C7657的无菌过滤版 2.0 – 5.0 > 1,200
C9697, XI-S型 C7657的经细胞培养验证且无菌过滤版 2.0 – 5.0 > 1,200

a, b FALGPA和胶原酶消化单元(CDU)均指的是单位每毫克/固体。

 

色谱层析法纯化的胶原酶
 

产品 注释 FALGPAa CDUsb
C0255, III型 痕量蛋白酶活性的纯化胶原酶 4 – 12 ≥ 250 
C0773, VII型 基本不含蛋白酶和梭菌蛋白酶的纯化胶原酶 4 – 12 1,000 - 3,000
C2799, VII型 C0773的细胞培养验证版 4 – 12 1,000 - 3,000
C2399, VII-S型 C0773的无菌过滤版 4 – 12 1,000 - 3,000
C9572, VII-S型 C0773的经细胞培养验证且无菌过滤版 4 – 12 1,000 - 3,000

a, b FALGPA和胶原酶消化单元(CDU)均指的是单位每毫克/固体。

 

含蛋白水解活性抑制剂的粗胶原酶
 

产品 注释 FALGPAa CDUsb
C6079, S型 XI型胶原酶和胰蛋白酶抑制剂混合物。经测试适合大鼠胰腺胰岛细胞(胰岛素分泌细胞)的消化和解离8, 9 2 – 5 最低1,000

a, b FALGPA和胶原酶消化单元(CDU)均指的是单位每毫克/固体。

 

Sigma胶原酶混合物

这类产品均可在胶原酶消化实验中实现更多的批次间重复性。混合物H和L中纯化的胶原酶(混合物F)与纯化的梭菌中性蛋白酶的比例不同,为研究人员提供了一系列的消化选择。
 

产品 注释 FALGPAa Proteasec
C7926, Sigma混合物F 主要是纯胶原酶。因为与CDU相比FAGPA的活性高,所以推测主要存在II型胶原酶。 Min. 2.0 < 10
C8051, Sigma混合物H 胶原酶活性中包含一些中性蛋白酶活性 Min. 1.0 Min. 10
C8176, Sigma混合物 真正的胶原酶,包含更多的中性蛋白酶活性。 < 1.0 Min. 40

a, c FALGPA和胶原酶消化单元(CDU)均指的是单位每毫克/固体。

 

 胶原酶检测

I型和II型纯化胶原酶不同之处在于,它们对天然胶原蛋白和合成底物的特异性以及相对活性不同。这两种胶原酶最主要的区别在于,它们对Sigma-Aldrich分析实验中使用的两种底物偏好不同。胶原酶消化单元(CDU)测定主要测量胶原酶I活性,它裂解长的未变性的胶原蛋白的三条螺旋链中的两条。在第二种胶原酶消化实验中,胶原酶II活性是通过该酶切割短合成肽N- [3-(2-呋喃基)丙烯酰基)] - 亮氨酸 - 甘氨酸 - 脯氨酸 - 丙氨酸(FALGPA,参见货号F5135)的能力来测定。胶原酶I或II的纯化制剂在消化各种类型的胶原蛋白或哺乳动物组织方面效率都不如这两种酶的混合物。仅含有胶原酶I或胶原酶II的纯化胶原酶在消化组织方面不如整体的粗胶原酶或纯化胶原酶与各种蛋白酶的组合更有效。很显然,真正的胶原酶和不同的天然蛋白酶(梭菌蛋白酶和氨肽酶)的组合,在消化不同的动物组织胶原蛋白时相互协助。对于组织消化,粗胶原酶产品一直是最有效的。一些研究人员尝试将色谱纯化的胶原酶与蛋白酶(如胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶)混合起来消化组织。

除了用于胶原酶活性的CDU和FALGPA测定,Sigma-Aldrich还测试每个产品批次中的酪蛋白酶14, 15、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶活性,以观察胶原酶产品中的蛋白水解酶活性。酪蛋白酶检测是三种测量协助消化动物组织的蛋白水解酶活性实验中最重要的分析方法。粗胶原酶中的梭菌蛋白酶含量必须减少(例如用二硫苏糖醇处理),因为该酶可能对实验室中的组织解离过程贡献很小。一些研究人员报道了梭菌蛋白酶可能有破坏性或毒性,因此须对它进行监测。

许多符合酶学参数的胶原酶产品也经过不同的大鼠组织测试。II型(C6885C1764)和VIII型(C2139)胶原酶批次测试它们从大鼠附睾脂垫中解离脂肪细胞的能力。然后在添加和不添加胰岛素的情况下测量葡萄糖氧化速率,通过代谢活性来筛选脂肪细胞。IV型(C5138C1889)和VIII型(C2139)胶原酶批次测试它们从大鼠肝脏解离有活性细胞的能力。V型(C9263C2014),XI型( C7657C4785C9407C9697)和S型(C6079)胶原酶批次必须从大鼠胰腺解离完整的胰岛细胞才能通过它们的产品测试。

 

 影响胶原酶消化组织的因素

基于我们自己的研发和与客户讨论的结果,显然,特定组织的解离和制备方式对胶原酶消化-解离速度和效率都有显著影响。组织供体年龄差异也可能是随时间变化的主要原因。请确保消化缓冲液中钙离子浓度为5 mM。螯合剂EGTA和EDTA可去除钙离子(酶稳定性和活性所需),从而严重抑制胶原酶活性。β-巯基乙醇16、半胱氨酸16和8-羟基喹啉-5-磺酸盐16也是胶原酶抑制物。一些较高特异性和活性的胶原酶能够确定浓度下导致过量细胞死亡。这种情况下,可减少胶原酶用量和/或添加0.5%的BSA或5-10%的血清,以稳定细胞来进一步消化。

 

问题 原因 解决方案 参考文献
消化作用不佳 酶活性不强

钙离子不足


酶量不足
在低温干燥条件下储存胶原酶。

胶原酶溶液分装后冻存。
胶原酶溶液中钙离子浓度为5 mM。

使用更多的胶原酶。可尝试蛋白酶活性更高的Sigma混合物。
6


7
解离的细胞被困住 破裂细胞的DNA解离

非蛋白胶不足
减少搅动
加入DNA酶**

在消化之前充分冲洗组织***
使用无镁离子的消化液
加入透明质酸酶
7
9

7
7
18
细胞死亡 蛋白酶过量


pH 改变


氧气太少
减少蛋白酶接触时间*
加入白蛋白或灭活血清

用缓冲液(例如HEPES)代替HCO-3.
经常检查并重新调节pH

给消化液通气(空气或氧气)
用更多的酶加速消化




7


19
细胞产量低 酶平衡


贴壁因子
使用更多的胶原酶*
在胶原酶中加入弹性蛋白酶**

首先灌洗组织以除去钙离子++***

20

7, 22
许多细胞受损 过多的蛋白酶


物理性损伤
减少蛋白酶用量*
加入白蛋白或灭活血清

非常温和地处理组织和细胞
21


7, 22
新批次不起作用 批次差异 使用组分分离的Sigma胶原酶“混合物”(Sigma货号C7926、C8051或C8176)*  

* 采用“Sigma混合物”产品(货号C7926C8051 或 C8176))分别制备胶原酶和蛋白酶,可以对每种用量进行可重复控制。 

** DNA酶会因过度搅拌而失活,并且加入的酶可能被胶原酶中存在的中性蛋白酶消化。

*** 使用EGTA(或EDTA)去除钙离子并冲洗掉微生物,然后用缓冲液清洗组织以除去螯合剂。请勿将EGTA或EDTA加入酶溶液中!

 

参考文献

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