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细胞色素C

细胞色素c是高度保守的~12 kDa蛋白质,由具有单个血红素基团的单个104个氨基酸肽组成,其中血红素基团与Cys14和Cys17共价连接。由于细胞色素c普遍存在且具有序列同源性,其已被用作分子进化的模型蛋白。1

 

序列同源性

 

 

物理性质

分子质量:3

12,384 Da(马)

12,327 Da(牛)

12,384 Da(鸽子)

12,588 Da(酿酒酵母)

12,233 Da(人)

等电点 (pI):4范围为10.0 - 10.5(马)

光谱性质:5(马)

λmax = 550nm(还原型)

EmM = 29.5(还原型,0.1 M磷酸盐缓冲液,pH 6.8)

EmM = 8.4(氧化型,0.1 M磷酸盐缓冲液,pH 6.8)

推荐水溶液的储存时间

-20℃(冷冻室)储存:6个月

2-8℃(冷藏室)储存:2周

20-25℃(室温)储存:3天

电子传递

细胞色素c通常称为携带电子的线粒体蛋白。在细胞内,细胞色素c在亚铁和三价铁状态之间转变,从而成为高效的生物电子转运体,并且在植物和动物的细胞氧化中起着至关重要的作用。一般认为细胞色素c是通用的呼吸催化剂,在呼吸性基质和氧气之间形成必要的电子桥。其在细胞呼吸中的主要功能是将电子从细胞色素c还原酶(复合物III)转运至细胞色素氧化酶(复合物IV)。

细胞凋亡

最近,细胞色素c被确定为细胞凋亡途径中的重要介质。5线粒体细胞色素c向细胞质中的释放刺激细胞凋亡,并且通常用作细胞凋亡过程的指标。6血清细胞色素c水平可能是治疗诱导的细胞死亡负担的指标7

在促凋亡条件下,两种Bcl-2家族蛋白Bax和Bak与线粒体外膜上通透性转换 (PT) 孔的电压依赖性阴离子通道组分结合。这种钙依赖性过程允许细胞色素C从线粒体的膜间隙释放到细胞质中。6

最初向细胞质中释放细胞色素c可导致细胞色素c与充当内质网外膜上的钙通道的肌醇-3-磷酸受体(IP3受体)结合。随后向细胞质中释放钙离子可诱导细胞凋亡。5

细胞色素c还作为凋亡蛋白酶活化因子 (Apaf) 的组分参与细胞凋亡的胞浆caspase蛋白水解级联反应。细胞色素c与Apaf-1结合,形成凋亡体蛋白复合物,该复合物可招募并激活pro-caspase 9 (Apaf-3)。然后激活caspase 9,促进caspase 3和7的下游活化,从而导致细胞凋亡。8因为caspase 9和caspase 3的活化均是钙依赖性的,所以细胞色素c介导钙从内质网释放有助于启动细胞凋亡级联反应。9

 

 细胞色素c通路示意图

 

细胞色素c的微过氧化物酶与催化活性

细胞色素c表现出过氧化物酶活性。该活性保留在保有结合的血红素基团的小肽片段中。这些含血红素的肽被称为微过氧化物酶,并且发现在组织学吸收研究中有用。

微过氧化物酶产品

 

T细胞受体研究

利用鸽子细胞色素c的独特序列激活特异性T细胞杂交瘤受体。10

用作蛋白质标准品

细胞色素c通常用作对照蛋白,用于以下几种应用:

制备方法

11或者,可以使用乙酸制备细胞色素c。三氯乙酸法可降低存在的超氧化物歧化酶 (SOD) 量,但往往会引起细胞色素c二聚化或产生酸修饰结构。相比之下,乙酸制备物的SOD量可能略高,但二聚体细胞色素c的比例较低。

细胞色素c的氧化态

Sigma主要以氧化型蛋白质提供细胞色素c产品。还原型细胞色素c可以用连二亚硫酸钠或抗坏血酸钠制备,然后进行凝胶过滤。12

以下程序来自细胞色素氧化酶的Sigma分析程序。将100 mg细胞色素c (C2506) 溶于8 ml 10 mM磷酸钾缓冲液 (pH7.0) 中。通过加入3-5 mg L-抗坏血酸钠盐 (A7631) 来减少细胞色素c。通过用10 mM磷酸钾缓冲液 (pH7.0) 透析来去除过量的抗坏血酸盐,在0-4℃透析18-20小时,期间更换三次缓冲液。从透析中取出,用缓冲液调至最终体积为10 ml。

细胞色素c产品

 

来自马心脏的BioUltra细胞色素c ≥99% (SDS-PAGE)

Sigma提供BioUltra级细胞色素c,用于需要最高纯度的应用。

目录号:C2867

异名:高铁细胞色素C(氧化态)

这种细胞色素c产品是使用三氯乙酸通过改进的公开方法由马心脏制备的。11或者,可以使用乙酸制备细胞色素c(目录号C7752)。三氯乙酸法可降低存在的超氧化物歧化酶 (SOD) 量,但往往会引起细胞色素c二聚化或产生酸修饰结构。相比之下,乙酸制备物的SOD量可能略高,但二聚体细胞色素c的比例较低。

该产品以冻干粉供应。冷冻干燥之前的最后一步是用6 mM氢氧化铵进行充分透析,因为氢氧化铵在冷冻干燥条件下具有挥发性,因此最终产品不应含有任何缓冲盐。该产品主要是氧化型蛋白质。还原型细胞色素c可以用连二亚硫酸钠或抗坏血酸钠制备,然后进行凝胶过滤。12

代表性批次的分析

C2867细胞色素c的三个代表性批次的MALDI-ToF质谱分析。

结果表明仅检测到细胞色素c的三种电荷态。

 

纯度:SDS-PAGE分析为99%

 

纯度:光谱分析为95%

通过HPLC-电喷雾MS对代表性批次进行纯度确认。在Supelco Discovery® 15 cm x 2.1 mm C8柱上用TFA:ACN梯度、在214 nm处UV检测来对C2867进行HPLC分析。

 

制备说明

细胞色素c可溶于水或pH 7.0±1.0的缓冲溶液(高达200 mg/ml),产生澄清的深红色溶液。对于一般用途,以10 mg/ml进行重构。

 

储存/稳定性

在-20℃储存细胞色素c。所提供的产品可稳定5年。

推荐水溶液的储存时间

  -20℃(冷冻室)储存:6个月

  2-8℃(冷藏室)储存:2周

  20-25℃(室温)储存:3天

 

 参考文献

  1. Margoliash, E. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1963, 50, 672–679.
  2. Handbook of Biochemistry; CRC Press; 1968.
  3. Brain Research; 1978, 153, 477–493.
  4. Van Gelder, B. F.; Slater, E. C. Biochim. Biophys. Acta 1962, 58, 593–595.
  5. Liu, X.; et al. Cell 1996, 86, 147–57.
  6. Masashi, N.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1998, 95, 14681–14686.
  7. Barczyk, K.; et al. Int. J. Cancer. 2005, 116, 167–173.
  8. Li, P.; et al. Cell. 1997, 91, 479–489.
  9. Tantral, Lee Cell Biochemistry and Function 2004, 22, 35–40.
  10. Bhayani H.; et al. J. Immunol. 1988, 141, 377–382.
  11. Hagihara, I.; et al. Biochem. Prep. 1958, 6, 1.
  12. Dixon, H. B.; McIntosh, R. Nature 1967, 213(74), 399–400.