二辛可宁酸(BCA)法测定蛋白质

1. 目的

提供用BCA法定量测定溶液总蛋白浓度的标准程序。
 

2. 范围

本方案适用于所有需要通过BCA方法进行蛋白质分析的受管制产品。
 

3. 讨论

蛋白质以浓度依赖性方式将碱性Cu(II)还原成Cu(I)。二辛可宁酸是Cu(I)形成络合物的高度特异显色剂,在562nm处吸光度最大。由于这种特质,562nm处的吸光度与蛋白质浓度成正比。牛血清白蛋白作为蛋白质标准品。
 

4. 定义

不适用
 

5. 责任

不适用
 

6. 流程

6.1 试剂

6.1.1 <a href=">二辛可宁酸溶液,产品编号B9643

6.1.2<a href=">五水合硫酸铜(II)4%溶液,产品编号C2284.

6.1.3 蛋白质标准溶液,1.0mg/mL牛血清白蛋白(BSA),产品编号P0914.

6.1.4 测试样品

注:其他BSA也可作为标准品。但是,如果需要稀释到1mg/mL,用E1%280=6.67在280nm处通过吸光度法确认蛋白质浓度。样品应在0.2-10mg/mL蛋白之间,以保持在本测定的线性范围内。用水稀释可能需要控制在该范围内。

6.2 材料

6.2.1 分光光度计,Uvikon 943,或等同物。

6.2.2 吸管/吸头

6.2.3 试管

6.2.4 试管架

6.2.5 一次性比色皿,产品编号C5416,或等同物。

6.2.6 孵化器,Imperial III蛋白染色剂,或等同物。

6.3 安全预防措施

请参阅材料安全数据表(MSDS),以了解化学品危害和适当的处理预防措施。

6.4 方法

6.4.1 将1毫升<a href=">硫酸铜(KK)五羟酸盐4%溶液(C2284)加入到49毫升二辛可宁酸溶液 (B9643)中,配制成蛋白质测定试剂。

6.4.2 定量地将标示量的水和蛋白质标准品加入到标示试管中。
 

mL水 mL蛋白标准品
1 0.5 0
2 0.3 0.2
3 0.2 0.3
4 0.1 0.4
5 0.0 0.5


6.4.3 按如下步骤制备反应管:样品准备一式两份。
 

mL蛋白标准品 mL样品或对照品 mg/mL蛋白质 mL蛋白测定试剂
1 1 - 0 2.0
2 0.1 - 0.4 2.0
3 0.1 - 0.6 2.0
4 0.1 - 0.8 2.0
5 0.1 - 1.0 2.0
6 - 0.1 ? 2.0
7 - 0.1 ? 2.0

6.4.4 振荡各管,确保充分混合。

6.4.5 将反应管置于37℃孵化器中孵育30分钟。

6.4.6 测量吸光度前让试管冷却至室温。

6.4.7 把分光光度计和水放在一起。测定562nm处标准品(管1-6)的吸光度。

6.4.8 利用标准品的已知蛋白浓度建立标准曲线。如果数据点显示与标准曲线线有明显偏差,请咨询相关监管部门。该线的斜率应该大约为1.0。

6.4.9 读取562nm处样品的吸光度。用标准曲线计算蛋白质浓度,单位为mg/mL。

6.4.10 最终蛋白浓度需乘以所有使浓度控制在测定线性范围内的稀释因子。报告取样本结果平均值。

6.4.11 完成相应的工作表。

7. 参考资料和附件

不适用