DNA和RNA纯化

GenElute™ mRNA小量制备试剂盒

Description
Features and Benefits
RNA Kits
Kit Contents
Preparation Time Comparison
RNA Yield
Specific mRNA Yield
mRNA—Suitable for Northern Blots


描述

诸如cDNA合成、表达谱构建等过程需要从含量相对更丰富的rRNA和tRNA中分离出mRNA。GenElute mRNA试剂盒为从预先制备的总RNA或直接从哺乳动物细胞和组织中分离聚腺苷酸化mRNA提供了便利的操作。

为了直接制备mRNA,用SDS 和蛋白酶K消化破坏细胞或组织以释放RNA并消除RNA酶。两种试剂盒均使用与1μm聚苯乙烯珠共价连接的寡聚dT30,从而通过杂交捕获聚腺苷酸化的mRNA。杂交过程中聚苯乙烯珠能够保持悬浮状态,而不需要像纤维素或磁性颗粒那样进行混摇。选择聚苯乙烯的另一个原因是,寡聚(dT)聚苯乙烯珠(2或3次洗涤)比更常用的寡聚(dT)纤维素(10次或更多次洗涤)需要更少的严格洗涤步骤,并能获得更清洁的mRNA。使用GenElute试剂盒,在离心滤柱上洗涤mRNA-珠复合物,并洗脱至10 mM Tris-HCl,pH7.5中。用任一试剂盒所制备的mRNA均能适用于多种下游应用,例如Northern印迹(图4)、表达阵列或芯片杂交、以及cDNA合成和文库构建。

GenElute mRNA Miniprep Flow Chart


GenElute mRNA小量制备试剂盒操作步骤

试剂盒内容物


特点和优点

快速 从总RNA中制备多聚腺苷酸+mRNA的时间是40分钟,直接从细胞和组织中进行制备需要60分钟。
方便 10分钟内,mRNA能够被捕获至聚苯乙烯珠上,该过程无需进行混摇操作。用微量离心滤柱洗涤珠子。
产量 产量高于所有竞争产品。

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GenElute mRNA试剂盒(总RNA起始材料)

货号
产品名
每个试剂盒纯化次数
容量(μg总RNA)
技术指南
简易操作步骤
GenElute mRNA小量制备试剂盒
10
5-500
GenElute mRNA小量制备试剂盒
70
5-500



GenElute mRNA直接提取试剂盒

产品号
产品名
每个试剂盒纯化次数
容量
技术指南
简易操作步骤
GenElute Direct
mRNA Miniprep Kit
10
up to 107    up to 50mg
cells         tissues
GenElute Direct
mRNA Miniprep Kit
70
up to 107    up to 50mg
cells         tissues

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试剂盒内容物

GenElute mRNA 试剂盒(于总RNA)

  • 水,分子生物学级
  • 2x 结合液
  • 寡聚核苷酸[Oligo(dT)]聚苯乙烯珠
  • 清洗液
  • 洗脱液
  • 带管离心柱
  • 收集管

GenElute mRNA直接提取试剂盒

  • 裂解液
  • 蛋白酶K和水合剂
  • 5 M氯化钠溶液
  • 寡聚核苷酸[Oligo(dT)]聚苯乙烯珠
  • 清洗液1 & 2
  • 洗脱液
  • 带管滤柱
  • 带管离心柱
  • 收集管

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制备时间比较

GenElute mRNA Prep Time
图1. 制备时间比较。使用GenElute mRNA小量制备试剂盒和其他市售试剂盒从总RNA或直接从细胞或组织中分离mRNA。根据每个试剂盒供应商所提供的操作步骤进行制备。

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RNA 产量

 
图2.使用TriReagent®通过二氧化硅结合法从Hek293细胞中制备总RNA。随后使用市售试剂盒,并按照每个供应商所提供的操作步骤,从所制备的总RNA中提取mRNA。使用RiboGreen TM RNA定量试剂盒(Molecular Probes)测定RNA产量。

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具体mRNA的产量

GenElute Specific mRNA Yield
图3. 如图2所示从总RNA中制备mRNA。取出制备得到的每个mRNA样品中的20%,并使用32P标记的探针进行Northern印迹杂交分析。用Perkin Elmer Instant Imager定量与人HGPRT、人p53和小鼠p53 的mRNA的杂交情况。

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mRNA—Suitable for Northern Blots

GenElute mRNA Northern Blot


图4. Northern印迹比较使用来自其他供应商的GenElute mRNA试剂盒所制备的mRNA。用Sigma的GenElute mRNA直接小量制备试剂盒(S)或用另一种市售的mRNA直接小量制备试剂盒(A, D, I, P, & Q)从5×10 6 Hek293细胞(左上图)或25-35 mg小鼠肝脏(右上图)中制备同一mRNA样品。在制备S+的过程中,加入了可选择的“释放和重新结合”步骤(如手册中所述):将RNA杂交捕获至寡聚dT珠上,再重新释放至新鲜的裂解溶液中,并在洗涤和洗脱mRNA之前重新捕获到相同珠粒上。在S- 和 Sx2的制备过程中省略了该“释放和重新结合”步骤。在Sx2的制备过程中,最终洗脱后,再用新鲜寡聚dT珠进行再次纯化(如手册中所述)。最后,每个mRNA制备产物(相当于1×106个细胞或10 mg肝脏组织)通过32P-标记的RNA探针进行Northern印迹杂交评估。所使用的探针靶向p53、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、c-myc、和/或甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA。

对于下图,首先从Hek293细胞和小鼠肝中制备总RNA。然后用Sigma GenElute mRNA小量制备试剂盒(S)或另一种市售的mRNA小量制备试剂盒(Q,A,I,P,D)从100μg这些总RNA制备产物中提取相同的mRNA样品。Sx2样品经洗脱后再次纯化。如上所述,通过Northern印迹对每种制备产物中的20%进行评价。在泳道T中,对5和2μg来自细胞的原始总RNA,或10和5μg来自肝脏的总RNA进行比较分析。

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扩增利用GenElute mRNA试剂盒提取的棉花mRNA

RT-PCR数据。 泳道(1):宽范围DNA标准品D-7058; (2):无模板对照; (3):GenElute mRNA –未经DNA酶处理; (4):GenElute mRNA –经DNA酶处理。


 

扩增利用GenElute mRNA试剂盒提取的烟草mRNA

RT-PCR数据。 泳道(1):宽范围DNA标准品D-7058; (2):无模板对照; (3):GenElute mRNA –未经DNA酶处理; (4):GenElute mRNA –经DNA酶处理。


 


使用Genelute试剂盒(货号MRN10)从辣椒叶提取mRNA

泳道1和7为宽范围DNA标准品D7058。泳道2和3分别显示在没有DNA酶处理和使用DNA酶处理条件下,mRNA制备无DNA污染。泳道3和4是使用1μg和100 ng叶片DNA为模板的PCR阳性对照。泳道9和10分别显示在没有DNA酶处理和使用DNA酶处理条件下,RbcL基因RT PCR扩增mRNA的结果。 DNA和RNA扩增子的大小为386 bp。


 


使用Genelute试剂盒(货号MRN10)从玉米叶中提取mRNA

泳道1和7为宽范围DNA标准品D7058。泳道2和3分别显示在没有DNA酶处理和使用DNA酶处理条件下,mRNA制备无DNA污染。泳道3和4是使用1μg和100 ng叶片DNA为模板的PCR阳性对照。泳道9和10分别显示在没有DNA酶处理和使用DNA酶处理条件下,RbcS基因RT PCR扩增mRNA的结果。 DNA扩增子的大小为601bp,RNA扩增子为438bp。


 


使用Genelute 试剂盒(货号MRN10)从甘蔗叶中提取mRNA

泳道1和7为宽范围DNA标准品D7058。泳道2和3分别显示在没有DNA酶处理和使用DNA酶处理条件下,mRNA制备无DNA污染。泳道3和4是使用1μg和100 ng叶片DNA为模板的PCR阳性对照。泳道9和10分别显示在没有DNA酶处理和使用DNA酶处理条件下,肌动蛋白(Actin)基因RT PCR扩增mRNA的结果。 DNA扩增子的大小约为2030bp,RNA扩增子为1057bp。

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