定量PCR

 什么是real time PCR (qPCR)?

定量PCR(qPCR)或实时PCR利用荧光报告分子定量扩增后产物。与传统PCR一样,这种方法也会扩增DNA、cDNA或RNA模板,但会在每个循环监测荧光以进行相对或绝对定量。该技术可用于大量的研究领域,包括基因表达分析、基因分型、miRNA分析、基因变异分析和蛋白分析。
 

 如何分析qPCR数据:

此过程会测量并定量报告分子的荧光;此类荧光通常来自于插入在双链DNA上的碱基间(结合)的染料(如SYBR® Green、溴化乙锭),或是设计与DNA上特定序列结合的探针(如分子信标、TaqMan®探针)。

有两种主要的qPCR数据定量方法。较为常用的相对定量法利用的是CT(阈值循环数)信息,即通过与对照基因相比并用某个参考基因的表达比值进行均一化后,从而测定样本中目标基因的表达或丰度比例。由于目标基因和参考基因的扩增效率E值有所不同,该方法也需要考虑E值间的差异。该方法更常用于基因表达分析。

第二种方法是绝对定量,更常用于环境微生物学并使用到了标准曲线(SC)。SC方法采用已知的模板浓度N0进行梯度稀释,并基于log(N0)与CT(阈值循环数)间的线性回归而创建标准曲线。随后将基于此计算样本的模板浓度。该方法的前提是样本与标准品的效率值相同。1,2

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