PCR/扩增

逆转录酶PCR(RT-PCR)

 RT-PCR背景和试剂

 

 何为RT-PCR?

逆转录酶PCR (RT-PCR)是标准PCR技术的一种变体,涉及从非常小的样品中获得的特定mRNA扩增。它减少了传统克隆技术中繁琐的mRNA纯化过程。在RT-PCR中,除标准PCR试剂外,还会使用逆转录酶和RNA样品。将反应混合物加热至37℃,逆转录酶以RNA样品为模版合成cDNA拷贝。然后该cDNA退火合成第一链的引物之一。之后启动标准PCR程序,最终合成双链DNA。

同时,所使用的引物必须与实验项目匹配。若需要扩增全部的细胞mRNA,寡聚(dT)引物就已足够,因为它们会退火至poly A尾。若要扩增特定的mRNA,则可使用编码区特异性引物。

RT-PCR是微生物学和病毒学中常用的诊断工具。该技术常与实时荧光定量PCR(qPCR)结合,广泛用于定量细胞和组织中的转录水平。

低丰度或复杂二级结构的转录本可能超出大多数RT酶的能力范围。Sigma提供多种试剂盒、试剂或预混液,以多种方式解决这些复杂转录本。

我们的产品融合了莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV),禽成髓细胞瘤病毒(AMV)或增强型AMV RT酶,经精心设计,能从复杂RNA样品中逆转录合成cDNA。RT酶将退火后的DNA引物延伸到RNA模板上合成cDNA。M-MuLV适用于较长的转录(> 5kb),因为与AMV相比,其RNA酶H活性较低。AMV RT酶具有较高的热稳定性,因此适用于复杂二级结构的转录。我们的RT酶可提供优质的第一链合成;增强型AMV RT酶可在较高温度下保持稳定,适用于低丰度和复杂二级结构的转录。从cDNA合成产品到RT-PCR产品,您可选择适合此过程所有步骤的试剂。

 

参考文献

  1. Rapley, Ralph, and David Whitehouse, eds. Molecular biology and biotechnology. Royal Society of Chemistry, 2014.

 RT-PCR试剂盒

我们的RT-PCR试剂盒提供了逆转录及对合成的cDNA进行后续PCR分析所需的一切组份。您可选择我们的增强型AMV试剂盒进行低丰度或复杂二级结构的转录实验。如果您正在寻求更方便的产品,请查看Titan 单管选项,可获得便捷,高保真度的逆转录和扩增。

 

货号 产品名称 特点
HSRT100 增强型禽 HS RT-PCR试剂盒 • 可用于一步或两步法RT-PCR的灵活试剂盒
• 高纯度eAMV-RT - 高温下转录复杂的二级结构
11939823001 单管RT-PCR试剂盒 • 由于其校对功能,降低了PCR的错配率
• 比标准Taq酶高三倍的保真度
11855476001 单管RT-PCR试剂盒系统 • 用于合成第一链cDNA的逆转录酶AMV
• 通过cDNA扩增校正的高保真酶

 

 cDNA合成试剂盒/混合物

我们提供多种试剂盒和混合物的选项以满足您的逆转录需求。您可以方便地选择多种类型的RT酶以及几种不同的包装类型。所有产品都包含合成第一链所需的一切组份,并有试剂盒附带单独的优化试剂或作为快速便捷的第一链合成的完整混合物使用。

 

货号 产品名称 特点
STR1 增强型禽第一链合成试剂盒 • 高纯度eAMV-RT - 在高温下转录复杂的二级结构
• 检测低丰度的mRNA
GE27-9261-01 第一链cDNA合成试剂盒 • 预装的批量反应混合物可节省时间并防止污染
• 包含有或无Poly(A)尾的mRNA的两条引物
11483188001 用于RT-PCR的第一链cDNA合成试剂盒 • 包含AMV RT以提高类似M-MuLV R的热稳定性
• 包含用于PCR的RNA酶抑制剂和dNTP混合物
RDRT ReadyScript™ cDNA 合成混合物 • 灵敏且便于使用的两步RT-PCR方案
• ReadyScript 酶是一种RNA酶H(+)修饰的M-MuLV RT
GE27-9263-01 Ready-to-go™ 第一链试剂盒 • 50个单剂量,环境温度稳定,第一链合成反应
• 每个试剂盒都含有NotI-(dT)18引物,克隆的FPLCpure M-MuLV RT,RNA酶抑制剂和dNTPs

 

 RT酶—逆转录酶

您可从我们的RT酶系列中选择适合您的RNA转录复杂性的酶。我们的产品包括标准的禽成髓细胞瘤病毒和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶以及这些酶更高灵敏度的增强型版本。

 

货号 产品名称 特点
A4464 增强型禽逆转录酶 • 对于低丰度mRNA有更高的灵敏
• 市场上对于复杂二级结构转录最好的酶
ERT-RO Expand™ 逆转录酶 • 将cDNA片段转录至13.5 kb
• 可以使用cDNA或单链DNA
M1302 M-MLV 逆转录酶 • 使用单链RNA,DNA或RNA-DNA杂合链
• 延伸第一链cDNA至7 kb
10109118001 逆转录酶AMV • 包含5X第一链cDNA合成缓冲液
11062603001 逆转录酶M-MuLV • 缺乏核酸内切酶活性,且与AMV RT相比RNA酶H活性较低

 

 其他试剂

除了我们的试剂盒和RT酶,Sigma还提供了多种试剂以满足您的实验需求。RNA酶抑制剂和引物选项可进一步助力您的RT-PCR实验。

 

货号 产品名称 特点
10814270001 cDNA合成引物 • 寡聚-p(dt)15
• 结合mRNA的3'-poly-A尾部以启动cDNA合成
R7647 随机九聚引物(cDNA引物) • 九个脱氧核糖核苷酸的随机序列
• 可以用作通用非特异性引物
RNAINH-RO 保护者 RNA酶抑制剂 • 在RNA分离和纯化过程中抑制RNA酶
• 在pH5.0至9.0及温度在+ 25°C至+ 55°C之间时有活性
R2520 核糖核酸酶抑制剂 - 人类 • 用于体外抑制核糖核酸酶
10786357001 核糖核酸酶H(RNase H) • 消除潜在的PCR错配
• 在随后的PCR过程中增加引物的亲和性