糖基化

O连接聚糖策略

在去除完整O连接聚糖方面,肽N-糖苷酶 F(PNGase F)的能力是无与伦比的。单糖必须经过一系列外切酶的连续水解,直至仅剩下Gal-b(1-3)-GalNAc核心。随后,O-糖苷酶可以去除无丝氨酸或苏氨酸残基修饰的完整核心结构。糖蛋白的变性可能不会显著增强O-去糖基化作用。任何核心结构修饰都会阻断O-糖苷酶的作用。最常见的核心Gal-b(1-3)-GalNAc修饰是单、双或三唾液酸化。a2-(3,6,8.9)-神经氨酸酶可轻松去除这些残基,因为只有该酶能够有效切割NeuAc-a(2-8)-NeuNAc键。另一种常见的O连接己糖结构包含b(1-4)-半乳糖和b(1-6)-连接N-乙酰葡糖胺以及唾液酸。b(1-4)-特异性半乳糖苷酶N-乙酰葡糖胺糖苷酶。非特异性半乳糖苷酶将水解核心聚糖上的b(1-3)-半乳糖,并剩余不能被O-糖苷酶去除的O连接GalNAc。b(1-4)-半乳糖苷酶和 b?N-乙酰葡糖胺糖苷酶可用于这些糖的水解以及任何其他包含 b(1-4)连接半乳糖或 b-连接N-乙酰葡糖胺(如聚乳糖胺)的O连接结构的水解。在O连接寡糖上发现的较为少见的修饰包括a连接半乳糖和a连接岩藻糖。直接的O连接N-乙酰葡糖胺(发现于核蛋白)和a连接N-乙酰半乳糖胺(发现于粘蛋白)也已被报道。当存在这些残基时,则需要使用其他外切酶实现完整的O-去糖基化。目前,蛋白质的直接O连接岩藻糖和甘露糖无法通过酶促反应去除。除了神经氨酸酶外,这类聚糖的水解还需要a和an

 

 内切糖苷酶特异性

PNGase F具有溶液和冻干粉末两种形式。PNGase F可以切割所有天冬酰胺连接的复杂、杂合或高甘露糖寡糖,除了含a(1-3)连接核心岩藻糖结构的寡糖。天冬酰胺必须以肽键连接在两个终点。去除聚糖后,天冬酰胺脱氨基成为天冬氨酸。

 

肽N-糖苷酶 A 水解的寡糖含有天冬酰胺连接N-乙酰葡糖胺的a(1-3)-连接N-岩藻糖结构,常见于植物或肠内寄生虫的糖蛋白中。这些聚糖可抵抗PNGase F的作用。与使用PNGase F相同,去除聚糖后,天冬酰胺脱氨基成为天冬氨酸。但是,如果N连接寡糖上存在唾液酸,则该酶无效。

 

O-糖苷酶  可水解丝氨酸或苏氨酸连接的无取代O-聚糖核心[Gal-b(1-3)-GalNAc]。任何核心结构修饰都会阻断O-糖苷酶的作用

 

内切糖苷酶F1  可切割寡糖的N连接二乙酰基壳二糖聚糖核心中的两个N-乙酰葡糖胺残基,生成截断的糖分子,其中,天冬酰胺上将剩余一个N-乙酰葡糖胺残基。内切糖苷酶可去除高甘露糖(寡聚甘露糖)和杂合结构的寡糖,但不能去除复杂寡糖。可在天然或非变性去糖基化条件下使用。

 

内切糖苷酶F2  可切割寡糖的N连接二乙酰基壳二糖聚糖核心中的两个N-乙酰葡糖胺残基,生成截断的糖分子,其中,天冬酰胺上将剩余一个N-乙酰葡糖胺残基。内切糖苷酶F2可以切割双天线型复杂寡糖和一定程度的高甘露糖寡糖。岩藻糖基化几乎不影响双天线型结构的内切糖苷酶F2切割。内切糖苷酶F2不切割杂合结构。可在天然或非变性去糖基化条件下使用。

 

内切糖苷酶F3  可切割寡糖的N连接二乙酰基壳二糖聚糖核心中的两个N-乙酰葡糖胺残基,生成截断的糖分子,其中,天冬酰胺上将剩余一个N-乙酰葡糖胺残基。内切糖苷酶F3能够低速切割无岩藻糖结构的双天线型和三天线型结构,但仅限于肽连接结构。双天线型结构的核心岩藻糖基化使活性增强高达400倍。内切糖苷酶F3对寡聚甘露糖和杂合分子无活性。内切糖苷酶F3还能切割游离或蛋白质连接寡糖上的岩藻糖基化三甘露糖基核心结构。复杂四天线型聚糖的天然去糖基化需要连续水解至三甘露糖二乙酰基壳二糖核心。

 

内切糖苷酶H  具有天然冻干粉末、重组溶液或含反应缓冲液的重组溶液三种形式。内切糖苷酶H可以切割N连接聚糖的二乙酰基壳二糖核心的N-乙酰葡糖胺残基。内切糖苷酶H可水解寡聚甘露糖和大部分杂合型聚糖,包括岩藻糖核心,但不能水解复杂型寡糖。

 

 酶促去糖基化试剂盒

E-DEGLY 试剂盒,用于一般酶促去糖基化br> Sigma的E-DEGLY试剂盒可以完成大部分N或O连接糖蛋白的去糖基化。该试剂盒含有在变性和一些非变性条件下对聚糖成分进行连续和完整水解所需的酶和试剂。

N-DEGLY 试剂盒,用于N连接聚糖的天然去糖基化
许多N连接糖蛋白可抵抗非变性条件下PNGase F的去糖基化作用。N-DEGLY试剂盒利用三种内切糖苷酶(F1, F2, F3)和反应缓冲液,克服了这一问题。

PP0200 ProteoProfile酶促胶内N-去糖基化试剂盒
该试剂盒经过优化,可为1D或2D聚丙烯酰胺凝胶块中的蛋白质样品提供方便和可重复的去糖基化和胰酶消化方法,所得产物可供后续MS或HPLC分析使用

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参考文献

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