蛋白质色谱

亲和色谱

亲和色谱法是生物选择性吸附和随后从固定相配体上回收化合物的优选方法,专用于对蛋白质和相关化合物实现高度特异性和高效的纯化。Sigma提供了固定在珠状多孔基质上的合适选择性配体以用于结合目标化合物,随后这些配体可在温和条件下回收。您可为下游应用选择最佳的基质。

 

 亲和基质的应用

亲和分类 潜在应用
活化/功能化 功能化间隔臂;载体基质;省去了毒性试剂的处理
氨基酸 血清蛋白质;蛋白质;多肽;酶;rRNA;dsDNA
亲和素生物素 生物素/亲和素及其衍生物的纯化;生物素化物质。生物素衍生物在非变性条件下解离。
碳水化合物结合 可溶性糖蛋白;其他含碳水化合物的物质
碳水化合物 糖蛋白;凝集素;其他碳水化合物代谢物蛋白质。适当的选择可以确保一步纯化。
染料配体 非特异性相互作用。模仿生物底物(底物,辅因子,效应物);蛋白质。使用不同染料优化纯化方案。
谷胱甘肽 谷胱甘肽酶和GST标记重组蛋白的纯化
肝素 普通亲和配体,可用于血浆凝血蛋白、核酸酶、脂肪酶等
疏水相互作用 含有游离羧基的偶联配体;蛋白质
IMAC 固定化金属亲和色谱。利用蛋白质和螯合金属之间的相互作用进行分离。
免疫亲和 定量测定抗原,高特异性
定量测定抗原,高特异性 脱氢酶;激酶;转氨酶。可靠的吸附剂。
核酸 mRNA; DNA; rRNA; 其他核酸和寡核苷酸
蛋白质A/蛋白质G 免疫球蛋白的纯化
特殊基质 特定种类或类型的蛋白质、辅酶或生理伴侣分子的纯化

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 活化/功能化基质

预活化载体使用户能够快速轻松定制合成亲和树脂,无需处理高度反应性试剂。Sigma提供了多种活化基质,可直接与各种配体偶联。通常,配体必须具有游离伯胺、巯基或羟基,才能直接连接。配体特性将成为选择合适基质的主要决定因素。

一直以来,溴化氢活化基质的使用非常广泛。它们可以在温和条件下高效偶联胺类官能团的能力,已经在很大程度上抵消了与该化学性质相关的配体浸出和离子性质问题。Sigma提供了多种可选的活化树脂,其偶联化学性质适用于稳定连接大多数类型的潜在配体。不同的活化化学性质将赋予亲和基质以不同的反应性和功能性特性。附表描述了各种直接活化类型的主要性质。

 

直接活化基质

活化 与树脂连接 可用的反应基团 基团特异性 反应条件 结合类型;连接稳定性 固有间隔臂
羰基二咪唑 氨基甲酸酯 咪唑氨基甲酸酯 pH 8-10 氨基甲酸酯;在pH低于10时,稳定性良好 1 原子中性
溴化氢 最后的异脲 氰酸酯 pH 8-9.5 异脲;中等稳定 1 原子阳离子
表氯醇 乙醚 环氧 SH>NH2>OH pH 7-8 SH
pH 9-11 NH2
pH >11 OH
硫醚仲胺乙醚;所有都非常稳定 3 中性原子
环氧(双) 乙醚 环氧 SH>NH2>OH pH 7-8 SH
pH 9-11 NH2
pH >11 OH
硫醚仲胺乙醚;所有都非常稳定 12 中性原子
N-羟基琥珀酰亚 最后的碳酸酯 琥珀酰亚胺 pH 8-9.5 氨基甲酸酯;在pH低于10时,稳定性良好 1 中性原子
对硝基苯基氯甲酸酯 最后的碳酸酯 硝基苯基碳酸酯 pH 8.5-10 氨基甲酸酯;在pH低于10时,稳定性良好 1 中性原子
三氟代乙烷磺酰氯 烷基胺硫醚 Tresyl sulfonate 胺, 硫醇 pH 7-9.5 烷基胺硫醚;两种都非常稳定 0 原子,直接连接
乙烯砜 磺酰硫醚 乙烯砜 SH>NH2>OH pH 6-8 SH
pH 8-10 NH2
pH >10 OH
硫醚仲胺乙醚;在pH低于9时,稳定性良好 5 中性原子, 一些非特异性效应


有些活化基质由于先前的衍生化而含有其他间隔臂。这些树脂可以使用更温和的偶联条件或与配体实现特异性更高的连接。具体实例如下:

整合到预先衍生化基质中的活性基团

活性基团 特异性 偶联条件 与配体结合;稳定性
N-羟基琥珀酰亚胺活化酯;活化酯 pH 6.0-8.0 胺;稳定性良好
二硫化物;基于离去基团的反应性 巯基 pH 6.0-8.0 共价二硫化物;在非还原性条件下,稳定性良好


Sigma提供了各种具有整合末端基团的基质,适用于定制衍生化或偶联。通常,这些基团为羧基或氨基,它们通过酰胺键与配体偶联,并需要使用其他试剂完成缩合。另一种常用的基团为酰肼,它们通过腙形成反应与醛类偶联,通常无需其他试剂。

 

参考文献:

  • Hearn, M. T. W. Methods Enzymol. 1987, 135, 102.
  • Kohn, J.; Wilchek, M. Appl. Biochem. Biotechnol. 1984, 9, 285-305.
  • Gilsema, W. J. et al. J. Chrom. 1981, 209, 363-368.
  • Miron, T.; Wilchek, M. Methods Enzymol. 1987, 135, 84-90.
  • Nilsson, K.; Mosbach, K. Methods Enzymol. 1987, 135, 65.
  • Angermann, K.; Barrach, H. J. Anal. Biochem. 1979, 94, 253-258.
  • Lihme, A. et al. J. Chrom. 1986, 376, 299-305.

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 氨基酸树脂

Sigma提供了多种通过氨基与溴化氢活化的4%琼脂糖偶联的氨基酸树脂。这些树脂可直接用于吸附对特定固定化氨基酸具有亲和力的化合物,或者可作为功能化连接物并通过它们的游离羧基末端共价连接到含有游离伯胺的配体上。

参考文献:

  • Dendriks, D. et al. Biochem. Biophys. Acta 1990, 1034, 86-92.
  • Cleary, S. et al. Biochem. 1989, 28, 188-1891.

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 亲和素/生物素基质

蛋白质亲和素对辅因子生物素(Kdiss 10-15M)具有极高的亲和力。这一特性使其成为一种独特且强大的分离和纯化工具。许多化合物可轻松实现生物素化,同时保留生物活性,因此适用于广泛的分离应用。Sigma提供了各种生物素化产品, 生物素化试剂 and 亲和素衍生物.

亲和素与生物素之间具有强相互作用带来的缺点就是完成解离需要苛刻的变性条件。为了避免苛刻的条件,可以使用亲和素与生物素之间具有强相互作用带来的缺点就是完成解离需要苛刻的变性条件。为了避免苛刻的条件,可以使用, 等生物素衍生物,它们可以在更温和的条件下与亲和素解离。或者,也可以使用单体亲和素,其对生物素的亲和力比中性四聚体低很多,从而可通过竞争性取代使复合物解离。

参考文献:

  • Wilchek, M.; Bayer, E. Methods Enzymol. 1990, 184, 5-13 & 194-200.
  • Bayer, E.; Wilchek, M. Meth. Biochem. Anal. 1980, 26, 1.
  • Green, N. M.; Toms, E. J. Biochem. J. 1973, 133, 687.

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  碳水化合物结合基质

凝集素是能够与糖基和凝集细胞结合的蛋白质。一旦固定化,凝集素便可以用于纯化指定糖复合物,并且通常可以使用抑制性单糖通过竞争性取代进行回收。凝集素树脂已被用于:

  • 纯化多糖
  • 分离细胞组分
  • 纯化糖蛋白和其他糖复合物分子
  • 从蛋白质溶液中去除含有杂质的碳水化合物
糖特异性 凝集素
β-D-gal(1-3)-D-galNAc Arahis hypogaea (花生)
Methyl-α-D-gal Artocarpus integrifolia (木菠萝)
α-D-man, α-D-glc Concanavalin A Type VI (伴刀豆球蛋白A)
α-D-man, α-D-glc 琥珀酰伴刀豆球蛋白A
糖复合物的末端α-D-甘露糖残基的非还原性末端 Galanthus nivalis (雪花莲)
D-galNAc Glycine max (大豆)
D-galNAc Helix pomatia (Roman 或食用蜗牛)
α-D-man Lens culinaris (扁豆)
Oligosaccharide Phaseolus vulgaris PHA-E (红芸豆)
(D-glcNAc)2, NeuNAc Triticum vulgaris (麦芽)
α-L-fuc Ulex europaeus UEA-1 (荆豆或金雀花)
大豆

参考文献:

  • Yamamoto, K. et al. Meth. Mol. Bio. 1993, 14, 17-34.
  • Chilson, O. P.; Kelly-Chilson, A. E. Eur. J. Immunol. 1989, 19, 389-396. (Abstract)
  • Tsuji, T. et al. Mol. Interact. Biosep. 1993, 113-126.
  • Debray, H.; Montrevil, J. Adv. Lectin Res. 1991, 4, 51-96.

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 染料配体树脂

染料配体色谱是利用共价结合的纺织染料(活性染料)来纯化蛋白质的亲和色谱。这些染料类似于对蛋白质具有亲和力的天然底物,因此,染料配体色谱有时被称为伪亲和色谱。固定化染料不是特异性吸附剂,而是对多种蛋白质具有广泛的结合能力。仔细研究合适的结合和洗脱条件后,即使对于含有其他蛋白质的混合物,也能够对目标蛋白质实现高度纯化。

参考文献:

  • Scopes, R. K. Anal. Biochem. 1987, 165, 235-246.
  • Scopes, R. K. J. Chrom. Biomed. Appl. 1986, 376, 131-140. (Abstract)
  • Lowe, C. R.; Pearson, J. C. Methods Enzymol. 1984, 104, 97-112.
  • Stellwagon, E. Methods Enzymol. 1990, 182, 343-357.
  • Miribel, L. et al. J. Biochem. Biophys. Meth. 1988 16, 1-15. (Abstract)

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 谷胱甘肽树脂

谷胱甘肽是一种三肽,由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。谷胱甘肽及其衍生物作为亲和色谱的配体非常实用,而分离谷胱甘肽需要使用酶。这些酶包括解毒酶,如:谷胱甘肽转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶和乙二醛酶I。近年来,谷胱甘肽琼脂糖树脂常用于融合蛋白的分离,因为融合蛋白含有谷胱甘肽转移酶 (GST)。通过将GST与重组蛋白融合,谷胱甘肽树脂可以从其他成分中分离出指定目标蛋白。

参考文献:

  • Smith, D. B.; Johnson, S. K. Gene 1988, 67, 31. (Abstract)
  • Guan, K.; Dixon, J. E. Anal. Biochem. 1991, 192, 262. (Abstract)
  • Nabell, L. M. et al. Cell Growth Differ. 1994, 5, 87-93. (Abstract)
  • Irzyk, G. P.; Fuerst, E. P. Plant Physiol. 1993, 102, 803-810. (Abstract)

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 肝素树脂

肝素是高度硫化的粘多糖,被广泛用作常规亲和配体。其高度的硫化作用赋予分子强酸性,因此它可以通过离子相互作用与许多物质结合。此外,肝素含有独特的碳水化合物序列,可作为某些蛋白质的特异性结合位点。固定化肝素已被用于纯化血浆凝血蛋白、核酸酶、脂肪酶和其他蛋白质。

参考文献:

  • Josic, D.; Bal F.; Schwinn, H. J. Chrom. 1993, 632, 1-10. (Abstract)
  • Farooqui, A. A. J. Chrom. Rev. 1980, 184, 335-345.
  • Sasaki, H. et al. J. Chrom. 1987, 400, 123. (Abstract)
  • Mitra, G. et al. Biotechnol. Bioeng. 1986, 28, 217.

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 疏水相互作用树脂

疏水色谱是基于蛋白质的疏水性对其进行分离和纯化的通用技术。色谱柱通常处于偏向于疏水相互作用的条件下,如高离子强度。这使疏水色谱成为用于盐沉淀后的理想工具。我们的疏水凝胶有三种功能可供选择:

  • 纯疏水树脂—这类凝胶含有通过稳定醚键连接的配体,并且不含带电区域
  • 混合性树脂—这类凝胶含有通过氨基连接的配体,在某些情况下将携带电荷
  • 氨烷基树脂—这类凝胶具有可能与其他官能团偶联的疏水性间隔臂

参考文献:

  • Walsh, M. P. et al. Biochem. J. 1984, 224, 117-127. (Abstract)
  • Shartiel, S. Methods Enzymol. 1984, 104, 69.
  • Kennedy, R. M. Methods Enzymol. 1990, 182, 339-343.

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 IMAC 基质

固定化金属亲和色谱(IMAC)是基于各种蛋白质与不同螯合/不溶性金属的特异性相互作用进行蛋白质分离的过程。这种相互作用取决于:

  • 蛋白质中某些氨基酸的相对含量和位置(即组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸)
  • 使用的金属类型

通常,不同的过渡金属可以与相同树脂螯合并在相同树脂内交换,但是,有些螯合基团可能会优先与特定金属螯合。常用的金属有:铜,锌,铁和镍。
 

金属 应用
纯化HIS标签蛋白
纯化HIS标签蛋白
通常用于纯化HIS标签蛋白和含有组氨酸的肽
通常用于纯化HIS标签蛋白
纯化磷酸肽
镓纯化磷酸肽  

参考文献:

  • Porath, J.; Olin, B. Biochem. 1983, 22, 1621. (Abstract)
  • Hutchens, T. W.; Yip, T. T. Anal. Biochem. 1990, 191, 160-168. (Abstract)
  • Yip, T. T.; Hutchens, T. W. Mol. Biotechnol. 1994, 1, 151-164. (Abstract)

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 免疫亲和基质

固定化抗体常被用作抗原定量检测(包括免疫球蛋白和半抗原)的分析工具。免疫沉淀联合SDS-PAGE是测定复杂蛋白质混合物(如,细胞裂解液)中抗原的数量以及是否存在的常用技术。使用各种固定化免疫化学物质,可根据细胞表面抗原对细胞进行分离。抗体-琼脂糖产品还被用于免疫吸附、亲和色谱等多种应用,并被用作固相二抗。由于这种多样性,Sigma提供了固定在4%交联琼脂糖上的多种抗体和全血清产品。

参考文献:

  • Rönnstrand, L. et al. J. Biol. Chem. 1987, 262, 2929. (Abstract)
  • Ho, K. J. Biotechnol. Appl. Biochem. 1991, 14, 296-305.
  • Bazin, H.; Malache, J. M. J. Immunol. Meth. 1986, 3, 19-24. (Abstract)

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 核苷酸/辅酶树脂

与基质结合的辅因子、辅酶和底物在蛋白质纯化中具有重要作用。由于将近1/3的已知酶都需要核苷酸辅酶,因此核苷酸结合树脂被用于纯化多种蛋白质。蛋白质与核苷酸辅酶的结合取决于间隔臂长度和配体连接位置。Sigma提供了广泛的核苷酸树脂,它们具有不同的连接位置和间隔臂,为化学家的亲和分离带来更高的灵活性。

参考文献:

  • Kiessling, P. et al. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1993, 374, 183-192. (Abstract)
  • Yamazaki, Y. et al. Biochem. 1991, 30, 1503-1509. (Abstract)
  • Ramandham, S. et al. Biochem. 1994, 33, 1442-1452. (Abstract)
  • Gonsky, R. et al. J. Biol. Chem. 1990, 265, 9083-9089. (Abstract)

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 蛋白质A/蛋白质G基质

蛋白质A和蛋白质G是细菌蛋白,可对多种免疫球蛋白的Fc(非抗原结合)部分产生特异性结合。蛋白质A和G亲和基质主要用于:

  • 免疫球蛋白的亲和纯化,主要是IgG
  • 从Fab片段中分离Fc

一直以来,蛋白质A树脂被广泛用于大多数潜在应用,而蛋白质G树脂已被证明能够增加和拓展应用范围。这两种蛋白质对各种免疫球蛋白具有不同的结合特性并且各具优势。其结合特性的主要差异在于:

  • 蛋白质 A
    • 广泛的物种反应性;与人、兔、牛和豚鼠的IgG结合良好
    • 与单克隆抗体的结合较弱
  • 蛋白质G
    • 更广泛的物种反应性;与小鼠、大鼠和山羊的IgG结合更强
    • 与单克隆抗体的结合更强

参考文献:

  • Akerström, B. et al. J. Immunol. 1985 135, 2589-2592. (Abstract)
  • Coleman, P. L. et al. J. Chrom. 1990, 512, 345-363.
  • Lindmark, R. et al. J. Immunol. Meth. 1983, 62, 1-13. (Abstract)

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 特殊树脂

以下为含有各种特殊亲和基质的产品的样品列表。每种树脂均列出了可能应用和参考文献。
 

树脂类型 纯化用途(应用),[参考文献]
白蛋白琼脂糖 类固醇,氨基酸,胆红素和血红素肽(用于常规疏水吸附和手性分离) [1,2]
对氨基苯甲酰胺琼脂糖 丝氨酸蛋白酶,尿激酶,纤溶酶原激活剂和蛋白酶去除[3,4]
间氨基苯基硼酸琼脂糖 糖蛋白(该基质具有高容量) [5]
N(对氨基苯基)草氨酸琼脂糖 神经氨酸酶和流感病毒 [6]
抗凝血酶III琼脂糖 肝素和凝血酶 [7,8]
抑肽酶琼脂糖 丝氨酸蛋白酶,尿激酶和蛋白酶去除 [9]
胆固醇半琥珀酸琼脂糖 HDL,LDL和胆固醇氧化酶 [10]
眼镜蛇神经毒素(α-Cobrotoxin)琼脂糖 烟碱乙酰胆碱(蛇毒素)受体 [12]
胎球蛋白琼脂糖 凝集素,糖苷酶和碳水化合物结合蛋白[12,13]
叶酸琼脂糖 叶酸结合蛋白 [14]
佛司可林琼脂糖 腺苷酸环化酶[15]
明胶琼脂糖 纤连蛋白[16,17]
血红蛋白琼脂糖 基于血红蛋白的O2载体 [18]
L-组氨酸重氮苯甲基膦酸(L-Histidyldiazobenzyl phophonic acid)琼脂糖 磷酸酶[19]
组蛋白琼脂糖 蛋白激酶[20]
蛋白激酶 二氢叶酸还原酶 [21]
胃蛋白酶抑制剂琼脂糖 组织蛋白酶D和凝乳酶 [22]
磷酸二酯酶3'-5'环核苷酸活化剂琼脂糖 钙调蛋白结合蛋白 [23,24]
O-磷酸-L-酪氨酸琼脂糖 磷酸酶 [19]
聚-L-赖氨酸琼脂糖 DNA, RNA & T4 噬菌体[25]
多粘菌素B琼脂糖 多粘菌素B琼脂糖 [26,27]
酒石酸琼脂糖 前列腺酸性磷酸酶 [30,31]
胰蛋白酶抑制剂琼脂糖 胰蛋白酶抑制剂琼脂糖 [32,33]

 

参考文献:

  1. Popov, D. et al. J. Mol. Cell. Cardiol. 1992, 24, 989-1002.
  2. Allenmark, S.; Bomgren, B.; Boren, H. J. Chrom. 1982, 237, 473.
  3. Winkler, M. E., et al. Biotechnology 1985, 3, 990-1000.
  4. Strickland, D. K. et al. Biochem. 1983, 22, 444. (Abstract)
  5. Bouriotis, V. et al. J. Chrom. 1981, 210, 267.
  6. Cuatrecasas, P.; Illiano, G. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1971, 44, 178.
  7. Byrun, Y. et al. J. Biomater., Sci. Polym. Ed. 1994, 6, 1-13.
  8. Thunberg, L. et al. Carbohy. Res. 1982, 100, 393-410. (Abstract)
  9. Johnson, D. A.; Travis, J. Anal. Biochem. 1976, 72, 573-576.
  10. Wichman, A. Biochem. J. 1979, 181, 691-698. (Abstract)
  11. Mosckovitz, R.; Gershoni, J. M. J. Biol. Chem. 1988 263, 1017. (Abstract)
  12. Haidar, M. et al. Glycoconjugate J. 1993, 9, 315.
  13. Mitsakos, A.; Hanisch, F. G. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1989, 370, 239-243. (Abstract)
  14. Salter, D. N. et al. Biochem. J. 1981, 193, 469-476. (Abstract)
  15. Pfeuffer, E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 3086. (Abstract)
  16. Ruoslahti, E. et al. J. Biol. Chem. 1979, 254, 6054-6059. (Abstract)
  17. Habeeb, A. F. S. A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981, 100, 1154-1166. (Abstract)
  18. Chiancone, E. et al. J. Chrom. 1992, 604, 117-123. (Abstract)
  19. Landt, M. et al. Biochem. 1978, 17, 915. (Abstract)
  20. Wallis, M. H. et al. Biochem. 1980, 19, 798. (Abstract)
  21. Cayley, P. J. et al. Biochem. 1981, 20, 874-879. (Abstract)
  22. Afting, E. G. Biochem. J. 1981, 197, 519-522. (Abstract)
  23. Niggli, V.; Zurini, M.; Carafoli, E., Methods Enzymol. 1987, 139 791-808. (Abstract)
  24. Dedman, J. R. et al. J. Biol. Chem. 1993, 268, 23025-23030. (Abstract)
  25. Sundberg, L.; Hoglund, S. FEBS Lett. 1973, 37, 70.
  26. Molvig, J.; Baek, L. Scand. J. Immunol. 1987, 26, 611-619. (Abstract)
  27. Issekutz, A. C. J. Immunol. Meth. 1983, 61, 274-281. (Abstract)
  28. Piepkorn, M. W. et al. Arch. Biochem. Biophys. 1980, 205, 315-322. (Abstract)
  29. Wooten, M. W. et al. Eur. J. Biochem. 1987, 164, 461-467. (Abstract)
  30. Van Etten, R. L. et al. Clin. Chem. 1978, 24, 1525. (Abstract)
  31. Lin, M. F. et al. Biochem. 1983, 22, 1055.
  32. Feinstein, G. et al. Eur. J. Biochem. 1974, 43, 569-581.
  33. Peterson, L. M. et al. Biochem. 1976, 15, 2501-2508. (Abstract)

 

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