蛋白质复合物免疫共沉淀法

FLAG®HA 系统

蛋白质复合物的分离和分析仍然是功能蛋白质组学研究中的主要技术挑战。免疫共沉淀是分离蛋白质复合物最广泛的方法。TAP(串联亲和纯化)法将串联的亲和标签结合靶蛋白分离内源性相互作用蛋白。与单一纯化相比,使用TAP分离的蛋白质复合物具有更高的纯度。

 

 

 FLAG HA系统概述

FLAG HA串联表位系统由非真核衍生的小表位标签组成。这些特点最大限度减少了对蛋白质功能的干扰,并具有卓越的特异性。FLAG HA肽的亲水性增加了双重表位结合于融合蛋白表面的可能性,以获得抗体-抗原相互作用。

其他TAP系统(包括谷胱甘肽硫转移酶,钙调蛋白,镍结合蛋白,链霉抗生物素蛋白和蛋白A)的应用均受到一些限制,如由于较大的TAP标签(20KD和更大)干扰复杂的装配或蛋白功能;非靶向内源性蛋白污染率高;需要TEV蛋白酶洗脱,增加了外来的细菌污染物。

FLAG HA系统的主要特点:

  • 与现有系统相比亲和树脂具有较高的特异性和较少的污染物
  • TAP标签不会在空间上影响目标蛋白的互作
  • 不需要蛋白酶洗脱
  • 高效和温和洗脱的第一次免疫沉淀以及第二次灵活的洗脱策略
图1FLAG HA串联亲和纯化系统的示意图。
整个过程包括六个简单的步骤:1)制备含有FLAG HA标签诱饵蛋白的起始材料; 2)将EZView ANTI-FLAG树脂直接加入到裂解液中; 3)将树脂转移到旋转柱冲洗; 4)用3X FLAG肽进行首次洗脱; 5)将第一洗脱液移至含有抗HA亲和树脂的离心柱,结合并冲洗;6)根据下游操作(尿素,HA肽或Laemmli样品缓冲液)用洗脱缓冲液进行第二次洗脱。

 

支持数据


图2使用植物材对FLAG和HA标签及亲和树脂的特异性分析。图A显示了7种不同植物提取物(烟草,拟南芥,玉米,大豆,稻,番茄和棉花)中抗FLAG和抗HA抗体分别对FLAG和HA标记的融合蛋白的高度特异性。免疫印迹检测采用ANTI-FLAGM2®-AP和抗HA-HRP抗体偶联物。图B显示了与现有树脂(抗FLAG,抗HA,蛋白G,CBP,抗生蛋白链菌素,镍和谷胱甘肽)相比,抗FLAG和抗HA树脂的特异性。冲洗后,与树脂非特异性结合的蛋白质在PAGE凝胶上洗脱分离,通过银染检测。与其他树脂相比,抗-FLAG和抗HA树脂均显示出最弱的交叉反应。图C说明与单次免疫沉淀相比,连续的免疫沉淀提供更高纯度的样品。
图3 哺乳动物细胞中著名的蛋白质-蛋白质相互作用系统,p53和T-抗原用于表征FLAG HA系统。使用FLAG HA串联TAP标签生成试剂盒(TP0020)将FLAG HA tandom标签并入p53,并在COS-7哺乳动物细胞中瞬时表达。用作诱饵蛋白的标记的p53与内源性T抗原互作形成复合物。使用TAP操作分离蛋白质复合物。该图说明了FLAG HA不会相互干扰。在这种情况下,优先使用尿素洗脱剂进行T抗原洗脱。用3X FLAG肽均匀洗脱树脂上的两种蛋白质。洗脱条件因使用的蛋白质和表达系统而变化。根据不同的应用和下游分析优化洗脱条件。

 

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