纯化和检测

咪唑

在用亲和凝胶纯化HIS标记的蛋白质时,以往总是将咪唑添加到洗涤缓冲液中以调节非特异性结合。但是,HIS-Select®技术具有很高的选择性,因此洗涤缓冲液中咪唑的量必须少于传统用量 (0-10 mM) (图1)。即使洗涤缓冲液中不含咪唑,与第3-5泳道相比,泳道2中使用HIS-Select亲和凝胶发生非特异性结合的可能性也很小。此外,在用10 mM低浓度咪唑洗涤的情况下,用HIS-Select亲和凝胶实际上消除了非特异性结合(泳道6)。使用10 mM以上的高浓度咪唑不会进一步降低非特异性结合。

图1:

在0或10 mM咪唑存在的情况下,将含有8 mg组氨酸标记的蛋白/ml树脂的大肠杆菌裂解物上样到树脂上,室温下旋转温育30 min。用洗涤缓冲液(50 mM NaPO4、300 mM NaCl,pH 8)洗涤树脂三次,用250 mM咪唑洗脱HIS标记的蛋白质。洗脱的蛋白质在凝胶上进行电泳并用EZBlue染色剂(G1041)进行染色。

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