一般考虑因素

设置实验室以避免污染

聚合酶链反应扩增单个分子的能力意味着微量的DNA污染物可以作为模板,从而导致该错误模板的扩增(假阳性)。考虑以下几点,以避免以下PCR污染来源:

  • 实验室工作台、设备和移液装置,这些地方可能被以前的DNA制剂、质粒DNA或纯化的限制酶断片污染过。
  • 样品间交叉污染。
  • 以前PCR扩增的产物。

实验室设施

  • 至少使用物理分隔的工作场所用于:
    • PCR前模板制备
    • 建立PCR反应
    • PCR后分析
  • 使用不含dna酶和rna酶的薄壁PCR管。
  • 使用特殊的抗气溶胶移液器吸头和专用(仅用于PCR)移液器套装,最好是正排量移液器。
  • 如有可能,在装有紫光灯的通风橱下设置PCR反应。在通风橱下存放微量离心机和仅用于PCR的一次性手套。

样品处理

  • 使用无菌技术,在PCR区工作时始终戴干净手套。经常换手套,特别是当你怀疑它们已经被含有模板DNA的溶液污染时。
  • 始终使用新的和/或灭菌的玻璃器皿、塑料器皿和移液器来制备PCR试剂和模板DNA。
  • 所有可以高压灭菌而不影响其性能的试剂和溶液都进行高压灭菌。当然,引物、dNTP和Taq DNA聚合酶不应该进行高压灭菌。有自己的一套只用于PCR的PCR试剂和溶剂。。将这些试剂分装保存。
  • 移液DNA时,避免产生可能携带污染物的气溶胶。
  • 始终设置对照反应,例如包含除模板DNA以外的所有反应组分的阴性(“无DNA”)对照,以及在以前的PCR中已成功使用的阳性对照。

专用设备

热循环仪的类型

热循环仪必须至少准确且可重复地保持3种PCR孵育温度(参见标准PCR的热循环曲线),在规定的时间内从一种温度变为另一种温度(“斜坡”),达到所选温度时不会出现明显的过冲或下冲,并可重复地在温度之间循环。

注:循环条件必须根据各自的热循环仪或引物/模板组合进行调整。

反应管类型

反应管会影响热循环仪向反应混合物传热的速率。因此,最好使用专为PCR而设计的薄壁反应管,并且这些反应管要正好适合您正在使用的特定品牌热循环仪的孔径。

PCR反应组分

模板

模板的质量影响PCR的结果。例如,DNA模板中的大量RNA可以螯合Mg2+,降低PCR的产量。而且,不纯的模板可能含有能降低反应效率的聚合酶抑制剂。

注:要得到最纯净的模板,请始终使用专门设计用于纯化DNA的纯化产品,如高纯度PCR模板制备试剂盒。

模板的完整性也很重要。模板DNA应具有高分子量。要检查DNA的大小和质量,请在琼脂糖凝胶上运行等分试样。检测新模板时,一定要包括阳性对照,其引物可扩增已知大小的产物并产生良好的产量。

反应中的模板量将强烈影响PCR中的性能。标准PCR的模板推荐量为:

  • 最多500ng的人类基因组DNA
  • 1-10ng细菌DNA
  • 0.1- 1ng质粒DNA

模板量较低,例如<10ng人类基因组DNA,则需要特定的反应改性,如改变循环次数、重新设计引物、使用热启动等。

引物

在大多数PCR应用中,决定整体测定成功的是引物的序列和浓度。为方便起见,可提供几种引物设计软件程序。这些程序可以用来确保引物序列具有以下一般特征:

  • 长18-24个碱基
  • 无内部二级结构
  • 40 – 60% G/C
  • G/C和A/T富集域的平衡分布。
  • 在3'末端彼此不互补(不会形成引物二聚体)。
  • 熔化温度(Tm),允许退火温度为+55至+65°C(最大特异性使用温度为+62至+65°C)。

注:最佳退火温度通常高于引物的Tm(约+5至+10°C),必须凭经验确定。对于两种引物,Tm应该相似。

可以在引物的5’端添加不与模板杂交的碱基(例如,用于在扩增产物中引入限制酶切位点)。通常引物浓度在0.1和0.6μM之间最佳。较高的引物浓度可能促进非特异性产物的错误引发和积累。较低的引物浓度可能在反应完成前耗尽,导致所需产物的产率较低。

注:对于某些系统,较高的引物浓度(高达1μM)可能会改善结果。在检测新引物时,一定要包括一个阳性对照反应和一个已经在PCR中检测过功能的模板。该对照反应将显示引物是否起作用。罗氏的人类基因组DNA是评估人类引物序列的良好对照模板。

DNA聚合酶的选择

DNA聚合酶的选择可以深入影响PCR的结果。对于大多数常规PCR,Taq DNA聚合酶长期以来一直是标准的PCR酶。但Taq DNA聚合酶有其局限性。对于大多数测定,热稳定DNA聚合酶(或聚合酶的混合物)的最佳量在0.5至2.5单位/50μl反应容积之间。酶浓度升高有时会导致特异性降低。

氯化镁浓度

Mg2+与dNTP形成可溶性复合物,以产生聚合酶可识别的实际底物。游离Mg2+的浓度取决于结合离子的化合物的浓度,包括dNTP、游离焦磷酸(PPi)和EDTA。为了获得最佳结果,需凭经验确定最佳的Mg2+浓度。最佳的Mg2+浓度可能在大约1-5 mM之间不等。最常用的Mg2+浓度为1.5mm(dNTP浓度为200μM)。Mg2+可影响酶活性并增加双链DNA的Tm。反应中过量的Mg2+可增加非特异性引物结合,从而增加反应的非特异性背景。

注:]对于Mg2+的简单优化,请参见罗氏PCR优化试剂盒

三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)浓度

始终使用所有四种dNTP的平衡溶液,以最大限度地降低聚合酶错误率。不平衡dNTP混合液会降低Taq DNA聚合酶的保真度。

注:为方便起见,可以将预混合的平衡dNTP混合物(如  PCR核苷酸混合物作为单一试剂加入反应混合物中。此外,PCR级dATPdGTPdCTPdTTP脱氧三磷酸核苷酸PCR级均可供货。

如果您增加dNTP的浓度,还必须增加Mg2+的浓度。dNTP浓度的增加会降低游离Mg2+,从而干扰聚合酶活性,减少引物退火。为防止残留污染,通常使用较高浓度的dUTP代替dTTP(详见用尿嘧啶-DNA糖基化酶防止残留污染)。最终的dNTP浓度应该是50-500μM(每份dNTP)。最常用的dNTP浓度是200μM。

pH值(酸碱度)

通常,用相应的热稳定DNA聚合酶(pH 8.3-9.0)供应的反应缓冲液的pH值将得到最佳结果。但是,对于某些系统,提高pH值可能会稳定模板并改善结果。

注:用罗氏的PCR优化试剂盒可以简单确定最佳反应pH值。

反应添加剂

在某些情况下,加入以下化合物可以增强PCR的效率或特异性:

  • 甜菜碱(0.5-2M)
  • 牛血清白蛋白(BSA;100ng/50µl)
  • 洗涤剂
  • 二甲基亚砜(DMSO;2 – 10%) (v/v)
  • 明胶
  • 甘油
  • 焦磷酸酶(0.001-0.1单位/反应)
  • 精脒
  • T4噬菌体基因32编码蛋白
  • 甲酰胺

这些添加剂的效果必须经过实证确定,如使用罗氏的PCR优化试剂盒确定。

标准PCR的热循环图谱

初始变性

模板DNA的完全变性至关重要。在+94~+95℃对PCR混合物进行2分钟的初始加热,足以使复杂的基因组DNA完全变性,使引物在反应混合物冷却时可以退火到模板上。如果模板DNA只是部分变性,就会倾向于非常迅速地“快速回复”,从而阻止有效的引物退火和延伸,或者导致“自引”,进而导致假阳性结果。

循环中的变性步骤

通常在+94到+95°C下变性20-30秒就足够了,但这必须适用于所用热循环仪和反应管。例如,在500μl反应管中比在200μl管中变性需要更长的时间。如果变性温度太低,则如前所述未完全融化的DNA将“快速回复”,因此将无法获得引物。对富含GC的模板DNA使用更长的变性时间或更高的变性温度。

注:切勿使用比模板DNA完全变性绝对需要更长的变性时间。不必要的延长变性时间会降低Taq DNA聚合酶的活性。

引物退火

就大多数实验目的而言,退火温度必须凭经验优化。引物退火温度的选择可能是设计高特异性PCR的最关键因素。温度过高,不发生退火,但过低,非特异性退火会急剧增加。如果引物具有一个或多个互补碱基,则会形成引物二聚体,这样两个引物的3’端之间就会发生碱基配对。

引物延伸

对于长达3 kb的片段,引物延伸通常在+72°C进行。Taq DNA聚合酶在+72°C时每秒可增加约60个碱基。对于1 kb的片段,45秒的延伸就足够了。对于长达3 kb的片段,每1kb延伸约需45秒。但是,这些时间可能需要根据特定模板进行调整。为提高产量,请使用热循环仪的循环延伸功能。例如,在恒定的延伸时间内执行前10个循环(例如,,1 kb产品需要45秒)。然后,在接下来的20个循环中,每个循环增加2-5秒的延伸时间(例如,第11个循环增加50秒,第12个循环增加55秒等)。循环延伸让酶有更多的时间来做它的工作,因为随着PCR的进展,有更多的模板可扩增以及更少的酶(由于在长时间高PCR温度下变性)可做延伸。

循环数

在最佳反应中,40个循环内可扩增不到10个模板分子,从而成为在溴化乙锭染色的凝胶上容易检测到的产物。因此,大多数PCR应该只包括25到35个循环。随着循环次数的增加,非特异性产物将逐渐积累(见图1)。

过度循环对不纯和纯模板的影响

图1:过度循环对不纯和纯模板的影响。PCR产物(来自多巴胺2受体基因外显子6的245bp扩增子)在一系列反应中可再扩增。在第一组实验中,模板在使用前未被纯化。在第二组实验中,模板在再扩增前通过琼脂糖凝胶电泳纯化。在两组实验中,模板可扩增40、60或72个循环。在3%琼脂糖凝胶上分析产物的等分试样(8μl)。
MWM:分子量标记
40,60, 和72:扩增循环次数。

结果:在这两组实验中,最低循环数(40)产生了最特定的产物。在60和72个循环扩增中,均出现了含有多聚体“特异性”PCR产物的涂片。
照片由德国柏林自由大学的U.Finckh和A.Rolfs提供。

最终延伸

通常,在最后一个循环后,反应管需在+72℃保持5-15分钟,以促进部分延伸产物的完成和单链互补产物的退火。

 

PCR酶的性质

表1显示了罗氏提供的PCR酶的应用概况。

显示了罗氏提供的PCR酶的应用概况。

 

表1:罗氏提供的PCR酶的应用概况。
长度 可以扩增的序列的长度。
特异性 如果要扩增困难的模板,特指非特异性扩增的程度。特异性越高,产生的副产物越少。
重现性 不同酶批次所得结果的一致性。
灵敏度 扩增效率与模板量的关系。如果模板有限,应采用灵敏度高的酶系。
稳健性 酶系易受污染物或其他可降低扩增效率的因素的影响,如强二级结构。
准确度 与Taq DNA聚合酶相比,由错误掺入的核苷酸的相对数量所定义的酶系错误率。
防残留 定义某酶系是否可以与dUTP一起使用而不是dTTP应用尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)进行PCR防残留程序。

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 RT-PCR中要考虑的因素

RT-PCR酶的选择

显然,在RT-PCR中,需要考虑的一个主要因素是用于合成cDNA的逆转录酶的选择。由于每种可用的酶都具有不同的酶性质,因此某种酶可能比其他酶更适合于特定的实验。下面讨论最重要的酶性质。

最适温度

较高的孵育温度有助于消除模板二级结构的问题。另外,高温通过减少错误引发可提高逆转录的特异性。因此,可以在高温(+50至70°C)下孵育的热活性逆转录酶更有可能产生准确的mRNA拷贝,特别是如果模板具有高GC含量的话。

注:在这样的高温下,只能使用特异性引物;不要使用oligo(dT)或随机六聚体引物。

二价离子需要量

大多数逆转录酶需要二价离子获得活性。使用Mg2+的酶可能比使用Mn2+的酶产生更准确的cDNA拷贝,因为Mn2+对DNA合成的保真度会产生不利影响。

特异性和敏感性

逆转录酶具有不同的复制少量模板的能力(敏感性)。它们在准确转录RNA二级结构(特异性)方面的能力也不同。

酶谱

表2显示了罗氏RT-PCR酶和试剂盒的应用概况。

罗氏RT-PCR酶和试剂盒的应用概况。

表2:罗氏RT-PCR酶和试剂盒的应用概况。

 

逆转录引物的选择

引发过程会影响所产生的cDNA的大小和特异性。有三种类型的引物可用于逆转录:

  • Oligo(dT)12–18,其与哺乳动物mRNA的3'末端的内源性poly(A)+尾部结合。该引物常产生全长cDNA。
  • 随机六核苷酸,在多种互补位点与mRNA结合,导致产生部分长度(短)cDNA。随机六核苷酸可能是克服模板中广泛二级结构所带来的困难的理想选择。这些引物也可以更有效地转录mRNA的5'区域。
  • 特异性寡核苷酸引物,选择性地引发目的mRNA。这种类型的引物已经非常成功地用于诊断分析。

模板RNA的制备

成功的RT-PCR需要高质量、完整的RNA模板。参考以下指南进行该模板的制备:

  • 为了尽量减少细胞裂解过程中释放的rna酶活性,在裂解混合物中加入保护rna酶抑制剂或使用可同时破坏细胞和灭活rna酶的方法。
  • 采取措施消除玻璃器皿、塑料器皿,试剂等所有潜在的RNase污染源。
  • 使用专门设计用于核酸纯化的产品制备起始模板RNA,如罗氏RNA制备产品。
  • 使用纯化的mRNA作为模板,而不是总RNA。从poly(A)+mRNA开始将大大增加成功扩增稀有mRNA的可能性,因为mRNA在总RNA制备物中的比例相当低(通常为哺乳动物细胞总RNA的1-5%)。
  • 如果以mRNA为模板,则在RT-PCR中使用前,通过凝胶电泳检查mRNA的完整性。mRNA应表现为大约500bp至8kb之间的涂片。大部分mRNA应该在1.5kb到2kb之间。

引物设计

特定mRNA序列的RT-PCR扩增需要两个特异于该mRNA序列的PCR引物。引物设计还应允许区分cDNA的扩增产物和源自污染基因组DNA的扩增产物。设计所需引物有两种方法(见图2)。

 

引物设计方法。

 

图2:引物设计方法。
第1小组:制作与内含子两侧外显子序列退火的引物。有了这些引物,从基因组DNA扩增的任何产物都将比从无内含子mRNA扩增的产物大得多。
第2小组:制作跨越mRNA上外显子/外显子边界的引物。这些引物不应扩增基因组DNA。

 

RT-PCR程序

RT-PCR可以作为两步法或一步法进行。各有一定优势。

1. 两步法

A.双管两步法

在第一管中,第一链cDNA合成在最佳条件下进行,使用随机六聚体,oligo(dT)引物(产生cDNA池)或序列特异性引物。然后将RT反应的等分试样转移到另一个管(含有热稳定DNA聚合酶,DNA聚合酶缓冲液和PCR引物)中进行PCR。

这种方法的优点:该方法可用于需要从相同RT反应或特定应用(如差异显示逆转录(DDRT)或cDNA末端的快速扩增(RACE))分析多个转录物的实验。此外,由于RT反应是在最佳条件下进行的,这种方法可产生最长的RT-PCR产物(如果使用合适的酶,长度可达14kb)。

B.单管两步法

第一步,逆转录酶在Mg2+离子、高浓度的dNTPs和特异性或非特异性[寡(dT)]引物(反应容积,20μl)存在下产生第一链cDNA。RT反应后,向管中加入优化的PCR缓冲液(不含Mg2+离子)、热稳定DNA聚合酶和特异性引物,进行PCR。当模板量有限时,这种方法可能有用,因为整个RT反应用于随后的PCR。

两步法具有以下优点:

  • 优化反应条件。两步法可以在最佳条件下同时进行逆转录和PCR,确保扩增的高效和准确。
  • 加强了灵活性。两步法可以将单个cDNA合成反应的产物用于多个转录物的分析。这种灵活性对于cDNA末端快速扩增(RACE)和差异显示逆转录(DDRT)等特殊应用很有价值。
  • 扩增长序列。利用逆转录酶和热稳定DNA聚合酶的正确组合,两步RT-PCR可以扩增长达14kb的RNA序列。

2. 单管一步法(偶联RT-PCR)

cDNA合成和PCR扩增均使用相同的缓冲液和位点特异性引物进行,无需在RT和PCR步骤之间打开反应管。除了这种方法(对比上述单管两步反应)具有更高的灵敏度外,一步法最大限度地减少了污染的机会,因为整个反应是在最少的移液步骤和不打开管的情况下进行的。此外,这种方法允许直接分析特定的转录物,因为两个步骤中使用的引物都具有序列特异性。最后,这种方法中使用的热活性逆转录酶允许较高的RT反应温度(+50至+72°C),通过消除二级mRNA结构,减少了假引发并增加了反应的特异性。

一步法具有以下优点:

  • 最小化所需时间。一步法反应比两步法反应移液步骤少,明显减少了进行RT-PCR所需的时间,消除了移液误差。
  • 降低污染风险。整个一步反应发生在单管中,不需要转移,也不需要打开反应管(PCR样品可能发生污染的步骤)。
  • 提高了cDNA合成的灵敏性和特异性。一步法反应的以下个特点使其能提供更高的产率和效率:(1)cDNA反应在高温下进行(以消除RNA二级结构的问题),(2)将整个cDNA样品作为模板进行PCR。

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 防止残留污染

用尿嘧啶-DNA糖基化酶防止残留污染

聚合酶链式反应(PCR)可以扩增超过十亿倍的单个分子。因此,即使微量的污染物也会被放大并导致假阳性结果。这类污染物往往是以前PCR扩增的产物(残留污染)。因此,研究人员开发了避免这种污染的方法。

一种常见的策略是在PCR扩增过程中将dUTP替换为dTTP,以产生含尿嘧啶的DNA(U-DNA)。在PCR扩增之前用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)处理后续的PCR反应混合物,随后在碱性条件下(初始变性步骤期间)在升高的温度(+95℃)下切割嘧啶多核苷酸,将从样品中去除污染性U-DNA(见图3)。当然,这个方法要求实验室所有的PCR反应都要用dUTP而不是dTTP来进行。

用尿嘧啶-DNA糖基化酶去除污染的U-DNA。

图3:用尿嘧啶-DNA糖基化酶去除污染的U-DNA。

在下游应用中使用含dU的PCR产物时要注意以下事项:

  • 当用作杂交靶标或作为双脱氧测序的模板时,含有dU的PCR产物表现与含有dT的PCR产物一样好。
  • 如果转化为无菌细菌宿主的话,含有dU的PCR产物可以直接克隆。
  • 含dU的底物很容易被一些常见的限制性内切酶(例如.,Eco RI和Bam HI)消化,而另一些在这些底物上则表现出活性降低(例如,Hpa I,Hind II,Hind III)。
  • 我们不推荐使用含dU的DNA进行蛋白结合或DNA-蛋白相互作用研究。

RT-PCR防残留污染

扩增RNA时有两种防残留污染方法:

  • 使用单管一步RT-PCR程序,以尽量减少操作和移液步骤的次数以及必须打开反应管的次数。这最大限度地减少了RT-PCR本身残留污染的可能性。
  • 在dUTP存在的情况下进行一步法RT-PCR,这样所有的产物都会含有dU,并可以用UNG从后续的PCR中去除(参见用尿嘧啶-DNA糖基化酶防止残留污染)。这样可防止后续PCR中的残留污染。


 故障排除

根据观察到的五种最常见的情况,以下是我们收集的有关PCR的一些疑难解答提示。在开始之前,请确保您已经查看了其他应用提示。

无产品

以下是我们收集的关于PCR不产生任何产物的疑难解答提示。

1. 非最佳镁2+浓度

建议:使用我们的PCR优化试剂盒滴定镁浓度。

2. 反应中模板量不是最优

模板的必要量因反应而异。指导意见是,每100微升反应使用100-750ng人类DNA(105-106个拷贝)。酶的用量应针对每个模板进行优化。

建议:

  • 滴定反应中模板的量。
  • 在建议范围内(0.5至5.0单位)进行酶浓度变化0.50增量的优化实验。

3. 反应中存在酶抑制剂

已知的PCR抑制剂包括:

  • 50mM氯化铵
  • EDTA 金属螯合剂
  • >0.8μM血红素
  • PBS(磷酸盐会结合游离镁)
  • >0.02%肌氨酰
  • 0.5 M尿素
  • >5%DMF
  • >10%甲酰胺
  • 肝素
  • >20%聚乙二醇脱氧胆酸盐
  • >0.01%SDS(可与等摩尔比的NP40和吐温20逆转)
  • >10% DMSO
  • >20%甘油
  • >0.4%正辛基葡萄糖苷
  • 残留酚
  • >0.06%脱氧胆酸钠
  • 焦磷酸盐

建议:减少或去除反应混合物中任何抑制剂的浓度。

4. 引物退火温度过高或过低

引物退火温度一般为+50~+60℃(根据引物序列和缓冲液成分可更高或更低)。

建议:根据以下公式确定Tm/退火温度:

如果引物为20-35个碱基
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G或C) + (# A或T)
Tp=有效退火温度±2-5

如果引物为14 - 70个碱基 
Tm=81.5+16.6(log10[J+])+0.41(%G+C)-(600/l)-0.063(%甲酰胺)+3至12
[J+]=一价阳离子的浓度
l=寡核苷酸的长度

5. 引物降解或不最优

引物应具有与G和C相同数量的A和T,它们至少应为14个碱基才具有特异性。

建议:

  • 如果引物较短且富含A—T,则加入0.9-2.0%(v/v)的DMSO。
  • 如果引物富含G-C,则加入1-10%(v/v)甲酰胺。
  • 复检引物序列,使用适宜的引物设计方案。
  • 检查凝胶上引物的等分试样以确保它们不被降解。

6. 不完全模板变性

变性步骤中加热不足是PCR反应失败的常见原因。反应达到完全链分离发生的温度是非常重要的。在大多数情况下,以约+94°C 的温度加热2分钟应该就足够。

样品一旦达到+94℃,即可冷却至退火温度。广泛的变性可能是不必要的,而有限的高温暴露有助于在整个反应过程中保持最大的聚合酶活性。

Mg浓度较高(4-5 mM)的DNA反应缓冲液可能需要较高的变性温度才能使DNA模板链完全分离。建议使用提供的缓冲液,不需要再添加镁。

建议:

  • 初始变性温度提高至+95~+97℃。
  • 将DNA减去酶和缓冲液变性4-6分钟。
  • 增加循环变性时间15-30秒。
  • 尝试热启动技术。
  • 封闭的环状DNA应在进行PCR前切割,未切割的环状物复原过快。

7. 基于计算机的错误

建议:

  • 校准加热块并确认实际块温度。
  • 运行特定机器的诊断程序-有关详细信息,请与机器制造商联系。

8. 由引物3'末端的模板的二级结构,骤回或过度同源引起的引发错误

建议:

  • 初始变性温度提高至+95~+97℃。
  • 将DNA减去酶和缓冲液变性4-6分钟。
  • 增加循环变性时间15-30秒。
  • 尝试热启动技术。
  • 加入T4基因32蛋白3-5µl/mL。
  • 设计引物时,确保3’端同源性不超过2个碱基。使用适宜的引物设计方案(如果有的话)。
  • 考虑在反应缓冲液中加入助溶剂:
    • 3—15% DMSO
    • 1-10%甲酰胺
    • 5-15%聚乙二醇
    • 10-15%甘油

9. NaCl浓度高于50mM

建议:降低NaCl浓度

10. KCl浓度高于50mM

建议:降低KCl浓度

错误掺入或低保真度

以下是我们收集的关于PCR反应的错误掺入或低保真度的一些疑难解答提示。

1. 非最佳镁2+浓度

建议:使用我们的PCR优化试剂盒滴定镁浓度。

2. 核苷酸浓度过高或不平衡

标准浓度为每个核苷酸20-200μM。

建议:

  • 检查所有核苷酸储备液浓度。
  • 复查所有核苷酸的最终浓度。

3. 反应缓冲液pH值过高

pH值为8.3为最佳。

建议:

  • 反应缓冲液的pH值可降至5-6。
  • 碱基置换变化减少60倍,移码变化减少11倍,单位pH降低3倍。

4. 由引物3'末端的模板的二级结构,骤回或过度同源引起的引发错误

建议:

  • 初始变性温度提高至+95~+97℃。
  • 将DNA减去酶和缓冲液变性4-6分钟。
  • 增加循环变性时间15-30秒。
  • 尝试热启动技术。
  • 加入T4基因32蛋白3-5µl/mL。
  • 设计引物时,确保3’端同源性不超过2个碱基。使用适宜的引物设计方案(如果有的话)。
  • 考虑在反应缓冲液中加入助溶剂:
    • 3—15% DMSO
    • 1-10%甲酰胺
    • 5-15%聚乙二醇
    • 10-15%甘油

5. 模板DNA受损

建议:

  • 尽量减少循环次数,因为在高pH下反复加热/冷却会损坏模板(大多数模板需要25-35个循环)。
  • 检查模板DNA的完整性。
  • 将循环变性时间缩短至15-30秒

非特异性条带

以下是我们收集的关于PCR反应后非特异性条带的一些疑难解答提示。

1. 非最佳镁2+浓度

建议:使用我们的PCR优化试剂盒滴定镁浓度。

2. 核苷酸浓度过高或不平衡

标准浓度为每个核苷酸20-200μM。

建议:

  • 检查所有核苷酸储备液浓度。
  • 复查所有核苷酸的最终浓度。

3. DNA污染/残留

建议:

  • 在不添加靶DNA的情况下进行PCR检测残留。
  • 避免残留(见下文)。

为防止残留,请使用良好的实验室操作规范:

  • 物理分离PCR制备物和产物
  • 高压灭菌溶液、吸头和反应管
  • 等分试剂,以尽量减少重复取样(每份不超过20次反应)
  • 使用外置活塞式移液器消除气溶胶
  • 预混剂
  • 最后加入DNA进行反应
  • 慎重选择阳性和阴性对照实验
  • 浸泡凝胶盒并在1M HCl中梳理以脱去DNA
  • 使用新的剃刀刀片切除条带
  • 用新鲜保鲜膜覆盖UV盒
  • 始终使用油覆盖

消除污染/残留:

  • 紫外线照射:混合除了模板DNA外的所有组分;在透明的0.5ml聚丙烯管中与玻璃透照仪(254和300nm紫外灯泡)直接接触照射5分钟。
  • UNG消化:将dUTP核苷酸掺入到反应中并进行随后的尿嘧啶DNA糖基化酶消化。

4. 引物退火温度过低

引物退火温度一般为+50~+60℃(根据引物序列和缓冲液成分可更高或更低)。

建议:根据以下公式确定Tm/退火温度:

如果引物为20-35个碱基
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G或C) + (# A或T)
Tp=有效退火温度±2-5

如果引物为14 - 70个碱基 
Tm=81.5+16.6(log10[J+])+0.41(%G+C)-(600/l)-0.063(%甲酰胺)+3至12
[J+]=一价阳离子的浓度
l=寡核苷酸的长度

5. 由引物3'末端的模板的二级结构,骤回或过度同源引起的引发错误

建议:

  • 初始变性温度提高至+95~+97℃。
  • 将DNA减去酶和缓冲液变性4-6分钟。
  • 增加循环变性时间15-30秒。
  • 尝试热启动技术。
  • 加入T4基因32蛋白3-5µl/mL。
  • 设计引物时,确保3’端同源性不超过2个碱基。使用适宜的引物设计方案(如果有的话)。
  • 考虑在反应缓冲液中加入助溶剂:
    • 3—15% DMSO
    • 1-10%甲酰胺
    • 5-15%聚乙二醇
    • 10-15%甘油

6. 引物降解或不最优

引物应具有与G和C相同数量的A和T,它们至少应为14个碱基才具有特异性。

建议:

  • 如果引物较短且富含A—T,则加入0.9-2.0%(v/v)的DMSO。
  • 如果引物富含G-C,则加入1-10%(v/v)甲酰胺。
  • 复检引物序列,使用适宜的引物设计方案。
  • 检查凝胶上引物的等分试样以确保它们不被降解。

7. 引物浓度过高

建议:调整引物浓度(每种引物0.1-1.0μM为最佳)。

8. 循环数太高

大多数模板需要25-30个循环。

建议:循环次数应基于模板DNA的起始浓度。

如果你的样本中目标分子的数量是... 那么我们推荐以下循环次数...
3 x 105 25 - 30
1.5 x 104 30 - 35
1.0 x 103 35 - 40
50 40 - 45

9. 模板与酶比率不正确

模板的必要量因反应而异。指导意见是,每100微升反应使用100-750ng人类DNA(105-106个拷贝)。酶的用量应针对每个模板进行优化。

建议:

  • 滴定反应中模板的量。
  • 在建议范围内(0.5至5.0单位)进行酶浓度变化0.50增量的优化实验。

拖尾条带

下面是我们收集的关于PCR反应后拖尾条带的一些问题解答提示。

1. 非最佳镁2+浓度

建议:使用我们的PCR优化试剂盒滴定镁浓度。

2. 核苷酸浓度过高或不平衡

标准浓度为每个核苷酸20-200μM。

建议:

  • 检查所有核苷酸储备液浓度。
  • 复查所有核苷酸的最终浓度。

3. DNA污染/残留

建议:

  • 在不添加靶DNA的情况下进行PCR检测残留。
  • 避免残留(见下文)。

为防止残留,请使用良好的实验室操作规范:

  • 物理分离PCR制备物和产物
  • 高压灭菌溶液、吸头和反应管
  • 等分试剂,以尽量减少重复取样(每份不超过20次反应)
  • 使用外置活塞式移液器消除气溶胶
  • 预混剂
  • 最后加入DNA进行反应
  • 慎重选择阳性和阴性对照实验
  • 浸泡凝胶盒并在1M HCl中梳理以脱去DNA
  • 使用新的剃刀刀片切除条带
  • 用新鲜保鲜膜覆盖UV盒
  • 始终使用油覆盖

消除污染/残留:

  • 紫外线照射:混合除了模板DNA外的所有组分;在透明的0.5ml聚丙烯管中与玻璃透照仪(254和300nm紫外灯泡)直接接触照射5分钟。
  • UNG消化:将dUTP核苷酸掺入到反应中并进行随后的尿嘧啶DNA糖基化酶消化。

4. 引物退火温度过低

引物退火温度一般为+50~+60℃(根据引物序列和缓冲液成分可更高或更低)。

建议:根据以下公式确定Tm/退火温度:

如果引物为20-35个碱基
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G或C) + (# A或T)
Tp=有效退火温度±2-5

如果引物为14 - 70个碱基 
Tm=81.5+16.6(log10[J+])+0.41(%G+C)-(600/l)-0.063(%甲酰胺)+3至12
[J+]=一价阳离子的浓度
l=寡核苷酸的长度

5. 由引物3'末端的模板的二级结构,骤回或过度同源引起的引发错误

建议:

  • 初始变性温度提高至+95~+97℃。
  • 将DNA减去酶和缓冲液变性4-6分钟。
  • 增加循环变性时间15-30秒。
  • 尝试热启动技术。
  • 加入T4基因32蛋白3-5µl/mL。
  • 设计引物时,确保3’端同源性不超过2个碱基。使用适宜的引物设计方案(如果有的话)。
  • 考虑在反应缓冲液中加入助溶剂:
    • 3—15% DMSO
    • 1-10%甲酰胺
    • 5-15%聚乙二醇
    • 10-15%甘油

6. dna酶活性(通过凝胶上的可见涂片显示低于预期的条带大小)

建议:

  • 制作新鲜的储备液。
  • 检查模板DNA的完整性。

7. 凝胶样品的油污染

引物退火温度一般为+50~+60℃(根据引物序列和缓冲液成分可更高或更低)。

建议:旋转反应管,小心地从表面提取油层。

8. 模板与酶比率不正确

模板的必要量因反应而异。指导意见是,每100微升反应使用100-750ng人类DNA(105-106个拷贝)。酶的用量应针对每个模板进行优化。

建议:

  • 滴定反应中模板的量。
  • 在建议范围内(0.5至5.0单位)进行酶浓度变化0.50增量的优化实验。

低产

以下是我们收集的关于PCR反应后产量低的一些疑难解答提示。

1. 引物退火温度过高

引物退火温度一般为+50~+60℃(根据引物序列和缓冲液成分可更高或更低)。

建议:根据以下公式确定Tm/退火温度:

如果引物为20-35个碱基
Tp = 22 + 1.46 (Ln)
Ln = 2(# G或C) + (# A或T)
Tp=有效退火温度±2-5

如果引物为14 - 70个碱基 
Tm=81.5+16.6(log10[J+])+0.41(%G+C)-(600/l)-0.063(%甲酰胺)+3至12
[J+]=一价阳离子的浓度
l=寡核苷酸的长度

2. 模板未清理或已降解

例如,蛋白酶污染会使聚合酶降解。

建议:

  • 尝试热启动技术。
  • 尽量纯化DNA模板,包括蛋白酶K消化。

3. 反应中存在酶抑制剂

已知的PCR抑制剂包括:

  • 50mM氯化铵
  • EDTA 金属螯合剂
  • >0.8μM血红素
  • PBS(磷酸盐会结合游离镁)
  • >0.02%肌氨酰
  • 0.5 M尿素
  • >5%DMF
  • >10%甲酰胺
  • 肝素
  • >20%聚乙二醇脱氧胆酸盐
  • >0.01%SDS(可与等摩尔比的NP40和吐温20逆转)
  • >10% DMSO
  • >20%甘油
  • >0.4%正辛基葡萄糖苷
  • 残留酚
  • >0.06%脱氧胆酸钠
  • 焦磷酸盐

建议:减少或去除反应混合物中任何抑制剂的浓度。

4. 反应中模板不足

模板的必要量因反应而异。指导意见是,每100微升反应使用100-750ng人类DNA(105-106个拷贝)。酶的用量应针对每个模板进行优化。

建议:

  • 滴定反应中模板的量。
  • 在建议范围内(0.5至5.0单位)进行酶浓度变化0.50增量的优化实验。

5. 延伸温度过高

最佳延伸温度和时间取决于片段大小:

  • 对于<500bp的片段,以+72℃加热20秒。
  • 对于1.2bp片段,以+72℃加热40秒。

建议:当存在较长的模板或疑似二级结构时,应延长加热时间而不应使用较高温度。

6. 酶活性低

对于罗氏聚合酶,在控制日期内可保证100%的活性。

建议:

  • 检查控制日期。必要时获取新鲜酶。
  • 尝试热启动技术,通过热循环帮助保持活性。

7. 循环数太高

大多数模板需要25-30个循环。

建议:循环次数应基于模板DNA的起始浓度。

如果你的样本中目标分子的数量是...

那么我们推荐以下循环次数...

3 x 105

25 - 30

1.5 x 104

30 - 35

1.0 x 103

35 - 40

50

40 - 45

8. 核苷酸水解

始终保存浓度至少为10mm的核苷酸储备液,100mm为最佳。在以1mM保存2个月后会发生明显的水解。

以10mm的预期浓度将NTP或dNTP溶于水中。使用0.05m三碱和pH试纸,调节pH至7.0。适当稀释中和的NTP或dNTP的等分试样,按下表给出的波长读取光密度。使用消光系数的值计算实际浓度。在-20°C条件下以小等分试样冷冻。

碱基

波长

碱基的消光系数(M-1cm-1)

A

259

1.54 x 104

T

260

7.4 x 103

G

253

1.37 x 104

C

271

9.1 x 103

U

262

1.0 x 104

锂盐和钠盐具有相当的稳定性,在PCR,测序和标记应用中同样适用。锂盐比钠盐更易溶于乙醇。因此,通过乙醇沉淀去除锂盐比去除钠盐更有效。使用锂盐核苷酸制剂可减少盐诱导的假象并增加测序凝胶的可读性。

9. 核苷酸浓度过高或不平衡

标准浓度为每个核苷酸20-200μM。

建议:

  • 检查所有核苷酸储备液浓度。
  • 复查所有核苷酸的最终浓度。

10. 引物浓度过低

建议:调整引物浓度(每种引物0.1-1.0μM为最佳)。

11. 基于计算机的错误

建议:

  • 校准加热块并确认实际块温度。
  • 运行特定机器的诊断程序-有关详细信息,请与机器制造商联系。

12. 高原效应

高原效应的可能原因/解决方案:

  • dNTP的使用-dNTP浓度应分别为20-200μM。
  • 最终产物焦磷酸盐的抑制-减少循环次数至20-35次,以减少焦磷酸盐的形成。
  • 高浓度时产物变性不完全——采用分步循环,增加后期循环的变性时间。
  • 底物/酶比率中的底物过量-使用分步循环,增加后期循环中的延伸时间或酶浓度。

13. 蒸发

蒸发会导致组分的浓度增加,从而可能会抑制酶的活性。容积的变化也会导致反应管内热分布的变化。

建议:使用100μl矿物油覆盖/反应。
 

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