HyStem™细胞培养

何为内毒素?

  • 小结
  • 为什么选择超纯HyStem水凝胶
  • 结构和物理性质
  • 内毒素污染的后果
  • 检测和测量
  • 污染源
  • 避免污染
  • 参考文献

  

小结

内毒素是小分子量、稳定、细菌来源疏水性分子,易污染实验室器皿,其存在可显著影响体外和体内实验。2它们的存在通过鲎变形细胞溶解物 (LAL)测定来检测,可检测低至0.01个内毒素单位(EU)/ml。实验室器具、原材料和实验室技术需要彻底洁净,以显著降低内毒素水平。Sigma公司的超纯HyStem系列产品根据这些指导方针生产,可获得符合体外和体内实验要求的产品。

  

为什么选择超纯HyStem水凝胶

为什么选择超纯Hystem水凝胶?人们越来越担心细胞培养、细胞疗法和组织工程应用中使用的培养基和基质中存在的细菌内毒素可能引起细胞功能异常并诱导宿主免疫反应。体内内毒素可引起热原样反应,程度与其浓度成比例。为了最大限度地减少这些担忧,必须使用几乎不含内毒素的试剂和生物材料来进行体外和体内生物医学研究。

Glycosan BioSystems的HyStem超纯低内毒素水凝胶系列可将细胞或宿主对这些污染物的反应减到最少,帮助研究人员获得更可靠的结果。

  

结构和物理性质

内毒素是在革兰氏阴性菌的外细胞膜中发现的复合脂多糖 (LPS)。内毒素由核心多糖链、O-特异性多糖侧链(O-抗原)和脂质组分(脂质A,负责毒性作用)组成(见图)。内毒素大小约为10 kDa,但容易形成高达1000 kDa的大聚集体。细菌在细胞死亡时以及它们积极生长和分裂时大量地释放内毒素。单个大肠杆菌含有约200万个LPS分子/细胞。内毒素具有很高的热稳定性,使其在常规的灭菌条件下不可能被破坏。2内毒素在溶液中是携带净负电荷的两亲分子。由于内毒素具有疏水性,它们可能与其他疏水性材料(如实验室中使用的塑料制品)具有很强的亲和力。出于这个原因,来自实验室烧杯、搅拌棒和其他实验室器皿的携带污染很常见。3

  

内毒素污染的后果

内毒素影响体外和体内细胞的生长和功能,并且是重大变异性的来源。在体外,有越来越多的证据表明,内毒素引起细胞培养研究的各种问题。记录的影响包括刺激白细胞培养物产生组织因子,在马巨噬细胞中诱导产生IL-6,以及通过极低水平(小于1 ng/mL)的内毒素抑制鼠类红系细胞集落形成。3在体内,内毒素在动物研究中引发炎症反应。注射用产品(疫苗和可注射药物)中内毒素的存在可导致发热和寒战到不可逆和致命的脓毒性休克的热原反应。

  

检测和测量

内毒素以内毒素单位/毫升 (EU/mL) 进行测量。一个EU等于约0.1至0.2 ng内毒素/mL溶液。由于与内毒素污染相关的风险很严重,美国食品药品监督管理局 (FDA) 对医疗器械和注射用药物的内毒素浓度设定了限制,研究人员均应了解。目前FDA的限制要求医疗器械的洗脱液小于0.5 EU/mL,除非器械与脑脊液接触(其限值为0.06 EU/mL)。2根据海洋生物学实验室科学家Fred Bang的观察结果,即革兰氏阴性菌即使被杀死也能使鲎 (Limulus polyphemus) 的血液变成半固体,开发了一种成功测量内毒素浓度的测定方法。后来才知道,由于内毒素含量很低,鲎变形细胞溶解物会凝固。该反应是1970年FDA批准用于检测与血液接触的药物、产品和器械的鲎变形细胞裂解物 (LAL) 测定的基础。1目前有三种形式的LAL测定,每一种的灵敏度不同。LAL凝胶块测定可以检测到低至0.03 EU/mL,而LAL动力学比浊法和显色法测定可以检测低至0.01 EU/mL。

  

内毒素污染源

水可能是实验室内毒素污染的主要来源。高纯度水是绝对必要的。虽然蒸馏和去离子柱不能去除内毒素,但是已经证明特殊的柱子或过滤系统是有效的。2如前所述,玻璃器皿、塑料制品和其他实验室设备带来大量污染,尤其是因为内毒素会强烈地粘附在玻璃器皿和塑料上。这些物品可以通过从溶液或物质中灭活热原(内毒素)来去除污染(去除热源)。内毒素的另一个来源是人的手指,需要戴清洁的手套小心地处理水和容器。化学试剂、原材料和缓冲液也都是内毒素的潜在来源。2在实验室使用前,应对这些物品进行彻底的内毒素检测。

  

Sigma如何避免内毒素污染?

Hystem化学家开始使用来自Millipore nanopure过滤系统的超纯水。接下来,他们使用特殊来源的低内毒素原材料(使用LAL凝胶块测定法严格检测内毒素)。此外,Hystem生产团队在制造产品时非常谨慎,包括使用丁腈手套以及专门在认证的化学通风柜中工作。所有玻璃器皿都使用设定在180℃的干燥箱去热原4小时,以保证灭活内毒素。最后,Hystem质量控制团队通过在产品发布之前进行最终的LAL凝胶块测定来确保每个输出产品保持在低内毒素水平。

  

参考文献

1.      “Endotoxin.” Wikipedia The Free Encyclopedia. 7 Jan. 2009.

2.      Gorbet, M.B. et al. Endotoxin: The Uninvited Guest. Biomaterials. 26: 6811-6817 (2005).

3.      Ryan, J. Endotoxins and Cell Culture. Corning Technical Bulletin. (2008).