干细胞生物学

小鼠胚胎干细胞培养步骤和实验方案

 介绍

转基因和基因敲低技术的发展为分析基因功能提供了有效的工具。这一技术的关键是实现体外分离和培养鼠胚胎干(ES)细胞。ES细胞来源于早期小鼠胚胎的内细胞团,可发育成包括种系组织的所有组织。体外培养和维持小鼠多能ES细胞的有效操作流程对于基因靶向实验的成功至关重要。MilliporeSigma提供广泛的优质小鼠ES产品,为研究人员提供方便且低成本的解决方案,从而实现小鼠ES细胞的可靠培养。这些产品包括ESGRO mLIF添加剂、原代小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠ES细胞系、干细胞选择的FBS、以及专用无血清培养基。

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这里所描述的细胞培养方案包括使用小鼠胚胎成纤维细胞和ESGRO mLIF在含血清培养基中的小鼠ES细胞的体外培养。应该注意的是,本手册中所提供的实验方案仅作为指导,我们鼓励研究人员对相应的培养实验方案进行优化以确保成功培养得到细胞。
 

 靶向ES细胞的实验纲要 – 分步介绍

计划一个从第1天到第16-19天的实验流程图。请注意,根据ES细胞的生长情况,培养时间可能可能必须进行改变。包括周末在内,电穿孔、选择、挑取以及DNA制备过程需要2-3周的时间。

 

 用明胶溶液涂覆平板

  1. 使用前将 0.1%明胶溶液 加热至室温。
  2. 在无菌条件下的培养罩中,按照右表中的建议在每个孔中加入明胶溶液。
    : 添加足量的明胶溶液以充分覆盖塑料平板表面。
  3. 盖上平板盖,并在层流净化罩中室温下将明胶溶液置于板孔中至少30分钟。
  4. 吸取并弃去明胶溶液。立即将培养基和细胞添加至培养皿中。添加细胞之前不要让培养皿干燥。



 平板接种原代鼠胚成纤维细胞(PMEF)饲养层细胞

EmbryoMax®原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)饲养层细胞是以冷冻小瓶形式提供,传代至第3代时每瓶约含5-6x106个细胞(每次传代约2-3次细胞群体倍增)。建议在接种ES细胞前一天接种PMEF饲养细胞,以保证PMEF细胞大约95%的细胞覆盖率。如果ES细胞在PMEF接种后的一天之内接种,则饲养层中可能会有一些小间隙。尽管在存在空隙的情况下接种ES细胞可能对ES细胞没有任何害处,但我们不推荐这样操作。

  1. 在复苏 PMEF 细胞前,用明胶溶液涂布平板/烧瓶(参见第III部分)。
  2. 在37℃水浴中快速复苏PMEF小瓶,并转移至15 mL管中(已含有10 mL温 PMEF 饲养细胞培养基)。
  3. 轻轻倒转试管以分散细胞,300xg离心4-5分钟。
  4. 取出上清液,在温PMEF饲养细胞培养基中重悬细胞沉淀。
  5. 从平板/烧瓶中取出明胶溶液,按照下表4.1中推荐的密度等分PMEF饲养细胞悬浮液。
  6. 在37℃、5%CO2条件下孵育PMEF饲养细胞。 使用图4A,B和C(下一页)作为估算正确PMEF密度和外观的参考。胶化板可以使用12-14天。



 使用ESGRO®培养基添加剂培养ES细胞

ESGRO®添加剂是小鼠LIF蛋白的特殊配方。与按重量出售的常规LIF不同,每批ESGRO®添加剂都是基于其生物活性销售的。ESGRO®mLIF培养基添加剂的好处包括:对小鼠ES细胞分化具有持续抑制效果,无批次间变异,以及在无饲养层条件下增加小鼠ES细胞生长的能力。

 

 无PMEF饲养细胞的ES细胞培养

  1. 将含有1x107 ES细胞的小瓶在4mL ES细胞培养基(含有1000单位/ mL的ESGRO®添加剂)中复苏。 离心(3-5分钟),并将细胞重新悬浮于10 mL ES细胞培养基中。 将ES细胞以1-1.5×106个细胞/ 25cm2(〜3×106个细胞/ 100mm平板)的密度铺在胶化的平板上。 将平板置于37℃,5%CO2条件下孵育。细胞外观应该类似于图5A中所示。
  2. 每天检查细胞以确定是否需要更换培养基(培养基颜色转变为黄色作为指示)。2-3天后,ES细胞培养物将聚集有大量细胞群落(见图5B)。此时,以1:5的比例传代ES细胞。
  3. 为了对ES细胞进行传代,按照前述内容准备两块100mm胶化板(参见第III部分)。 弃去ES细胞培养基,用DPBS洗涤平板两次,并加入1.2mL胰蛋白酶。 37℃孵育平板2分钟,随后加入10mL ES细胞培养基。用力吸打以打碎ES细胞聚集体(避免气泡形成)。
  4. 向含有8mL ES细胞培养基的每个胶化板中加入2mL细胞悬液。将过量的ES细胞以每瓶2-10 x 106个细胞的浓度冷冻以备将来使用。请注意,ES细胞应该在计划电穿孔的前一天进行传代。



 含PMEF饲养细胞培养ES细胞

  1. 将含有1x107 ES细胞的小瓶在4mL ES细胞培养基(含有1000单位/ mL的ESGRO® 添加剂)中复苏。离心(3-5分钟),并将细胞重新悬浮于10 mL ES细胞培养基中。
  2. 从先前制备的培养板中取出PMEF饲养细胞培养基(参见第IV部分),并将ES细胞以 1-1.5×106个细胞/ 25cm2(〜3×106个细胞/ 100mm平板)的密度铺在胶化的平板上。 将平板置于37℃,5%CO2条件下孵育。细胞外观应该类似于图5C中所示。
  3. 每天检查细胞以确定是否需要更换培养基(培养基颜色转变为黄色作为指示)。2-3天后,ES细胞培养物将聚集有大量细胞群落(见图5D)。 此时,以1:5的比例传代ES细胞。
  4. 为了对ES细胞进行传代,按照前述内容准备两块含PMEF细胞的100mm胶化板(参见第4部分)。 弃去ES细胞培养基,用DPBS洗涤平板两次,并加入1.2mL胰蛋白酶。 37℃孵育平板2分钟,随后加入10mL ES细胞培养基。用力吸打以打碎ES细胞聚集体(避免气泡形成)。
  5. 向含有8mL ES细胞培养基的每个胶化板中加入2mL细胞悬液。将过量的ES细胞以每瓶2-10 x 106个细胞的浓度冷冻以备将来使用。请注意,ES细胞应该在计划电穿孔的前一天进行传代。

 

 ES细胞电穿孔

  1. 在进行电穿孔之前的晚上,准备4个含有 PMEF细胞的平板(参见第IV部分)。
  2. 次日早晨,用新鲜的 ES 细胞培养基培养的ES细胞,准备进行电穿孔。
  3. 当天下午晚些时候,如前所述收集ES细胞,并进行细胞计数。电穿孔所需的最小ES细胞数量为1x107个ES细胞。如果有过量细胞,可按照前述内容将细胞进行冻存。
  4. 将电穿孔所需的细胞以300xg离心10分钟,然后吸出培养基。
  5. 将ES细胞沉淀重悬于600μL 电穿孔缓冲液中。
  6. 25-40μg敲除DNA重组载体(纯化的)应先经过线性化,乙醇沉淀,并干燥成沉淀。在无菌罩中,将DNA沉淀溶解在30μL电穿孔缓冲液中,然后将溶液加入到ES细胞中。 充分混合并在室温下放置5分钟。
  7. 将ES细胞放入0.4cm电穿孔比色杯中。 在500μFD,0.24kV条件下电穿孔悬浮液。电击时间通常应该在6.9和7.9毫秒之间(最佳7.2)。电穿孔后,将比色杯在冰上放置10分钟。
  8. 将电穿孔的ES细胞转移至40mL ES细胞培养基中并使用巴斯德吸管轻轻混合。
  9. 将ES细胞悬液(每个培养板10mL,共4个平板)均分至平板中。确保在添加细胞之前将PMEF饲养细胞培养基移除。
  10. 在进行抗生素筛选前,在37℃和5%CO2条件下孵育大约36小时。

 ES细胞的选择

选择之前,建议应确定每个ES细胞系的致死曲线,以确定准确使用的药物浓度。以下的选择规则可以作为参考:

  • 用于129SVEV和129SVJ细胞中的新霉素(G418): 前两天为350μg/ mL,剩余的选择时间为150μg/ mL。总共5-7天的选择时间
  • 用于C57BL6 / J细胞中的新霉素(G418):第一天为275μg/ mL,第二天为200μg/ mL,剩余的选择时间为150μg/ mL。选择总共6-8天的选择时间
  • 用于129SVEV和129SVJ细胞中的潮霉素B:前两天为100μg/ mL,随后一天75μg/ mL,剩余的选择时间为50μg/ mL。总共7-10天的选择时间
  1. 为了选择转化体,加入含有 新霉素 (G418)潮霉素 B的ES细胞培养基。
  2. 48小时后,细胞死亡应该是非常明显的。如果有明显的碎片或者培养基变色,应当每天更换培养基,否则每隔一天更换就足够了。如果碎片附着在活细胞上,请在更换培养基前用无菌DPBS轻轻洗涤细胞,注意不要移动饲养细胞层。电穿孔后应将ES细胞培养约10天。

 细胞群落挑取

根据所使用的细胞系和培养基,电穿孔后5-10天,ES细胞群落通常已可进行挑取。最适合进行挑取的群落应当是那些呈圆形或椭圆形的细胞群落,边缘相对明亮,并且通常具有黑色的坏死中心。分化的群落呈扁平状,并且常常被呈鹅卵石样结构的成纤维细胞样细胞包围。在选择细胞时应尽量避免选择这些细胞。根据所使用的ES细胞系的不同,可以将ES细胞挑取至胶化板或PMEF饲养细胞层上。如果倾向使用胶化板,请忽略饲养层细胞的使用,并按照以下步骤中的说明进行。

  1. 在挑取ES细胞群落之前一天,用 PMEF 细胞(参见第IV部分)或 明胶 (参见第III部分)涂布适当数量的24孔板。
  2. 在选择ES细胞群落之前,确保您戴着手套,实验服和面罩。包括显微镜、实验台、吸头盒和移液器在内的所有表面应在使用前用乙醇擦拭。
  3. 在4倍放大倍数下检查ES细胞培养物。选择挑取的细胞群落应充分分开,以确保不受周围群落的污染。当找到目标群落时,用移液枪头在细胞群落周围画圈,以松开周围的成纤维细胞层。使用移液器将容量设定为15μL,用移液器尖端刮下群落以移出细胞群落,然后吸取细胞(菌落在尖端内可见)。 将挑取的细胞群落转移至96孔板孔中。
  4. 每次使用新枪头继续挑取并转移ES细胞群落至新的孔中,直至挑出合适的数量。通常建议进行分批(48个细胞每批)挑取克隆以防止疲劳。
  5. 每孔加入一滴 胰蛋白酶,37℃孵育2分钟。在此期间,用500μL PMEF 细胞培养基 更换24孔板中的PMEF细胞培养基
  6. 使用移液管将每个ES细胞克隆分散至96孔板中以分散每个群落,该过程应避免过度起泡。将悬浮液转移至含有500μL ES细胞培养基的24孔板(包括泡沫),每个孔均应使用新的枪头。
  7. 在转移所有群落时,使用设置为400μL的干净移液器吸头混合每个孔。 37℃,5%CO2条件下孵育。每天补充添加新霉素 (150 μg/mL)或潮霉素(50 μg/mL)抗生素的培养基。
  8. 在几天内,应可观察到明显的新细胞群落产生。如果群落彼此靠得太近,用1 mL移液管尖将群落分散以破碎群落并扩散细胞(因为群落非常容易分散,因此不需要胰蛋白酶)。收集前每孔应均匀覆盖有细胞群落。
  9. 每天继续更换ES细胞培养基,直到每个孔的菌落达到良好覆盖(通常为7-10天)。

 故障排除指南

构建敲除小鼠时最常遇到的两个问题是:(1)ES细胞分化;(2)建立了目标ES细胞克隆后,无法产生嵌合体。表25.1列举了ES细胞分化的一些常见原因,并提出了如何帮助防止分化发生的建议。ES细胞分化的程度可以通过检查ES细胞群落的形态来确定,或者使用EMD Millipore的ES 细胞鉴定试剂盒碱性磷酸酶检测试剂盒进行更全面的评估。这些试剂盒含有针对ES细胞标记物的单克隆抗体和碱性磷酸酶检测试剂,可以区分多能干细胞和分化ES细胞。表25.2中还包含了许多导致ES细胞生长缓慢的原因。表25.3包含了无法生成嵌合体的可能原因。

ES细胞分化的常见原因和建议。
 

细胞分化的原因 建议
mLIF浓度不正确 在ES细胞培养基中,应使用ESGRO®mLIF培养基添加剂,建议浓度为1000单位/ mL。
ESGRO®Media的到期日期 使用前务必检查每批的日期。培养基应少于4周龄,因为谷氨酰胺副产物可能对ES细胞有毒性。胚胎干细胞应该每2-3天更换一次新鲜培养基或者待培养基变色后更换。
血清 应该检测新批次的胎牛血清诱导分化的效果。ES细胞培养基通常需要10%至20%的血清浓度。我们推荐使用EmbryoMax ES细胞验证过的血清。
缺少传代 频繁传代能够移除分化的细胞,因此ES细胞应每2-3天传代一次。只有未分化的ES细胞才能在频繁传代中存活。有关ES细胞融汇和分化的ES细胞的图示,请参阅图25A-25G。
消毒剂 应在培养ES细胞的组织培养室和培养箱中避免使用Roccal®或Lysol®等消毒剂。 一些消毒剂可能会因使用喷雾擦拭产生的水浴和气雾而导致细胞分化。建议使用70%乙醇清洁组织培养表面。
饲养细胞 如果用配有胶化板的ESGRO®mLIF培养基不能控制分化,可能需要在饲养细胞层上对ES细胞进行培养。请参阅第4部分推荐使用的生长停滞成纤维细胞数量。同时,应添加浓度为1000单位/ mL的ESGRO®添加剂以帮组维持未分化的ES细胞。
培养箱设置 确保培养箱正确设置为37℃和5%CO2。
ES细胞的生长速率 生长缓慢的ES细胞最有可能正在进行分化。如果细胞生长不够快,请增加血清浓度。
明胶 任何时候优选选择使用细胞培养级明胶(即使使用了饲养层),从而使组织培养板上的表面差异最小化。建议使用EmbryoMax®ES细胞验证的0.1%明胶溶液。
低水平的污染 在培养基中经常使用Pen / Strep可以消除诸如支原体等病原体的低水平污染。建议定期测试您的ES细胞系的支原体污染。

 

ES细胞生长缓慢的原因和建议。
 

ES细胞生长缓慢的原因 建议
血清不足 理想情况下,使用浓度在10%和20%之间的血清;然而,这也应根据每个ES细胞株而进行改变。建议对新批次血清进行常规检测,以确定快速生长所需的最适浓度,且不会诱导过度分化。我们推荐使用EmbryoMax®ES细胞验证的血清。
ES细胞数量少 当细胞略富集时ES细胞生长最佳。 从冷存或传代细胞中提高接种密度以增加个体群落数量。有关ES细胞融汇的图示,请参阅下图。

 

缺乏嵌合体的原因。
 

缺乏嵌合体的原因 建议
培养ES细胞所花的时间
cells
一旦确定了目标ES细胞克隆,将ES细胞保留在培养物中的时间降至最低。 在显微注射和/或聚集之前,最好传代ES细胞系不超过1-2次。
对ES细胞进行核型分析 建议对ES细胞进行常规核型分析,特别是当ES细胞系达到高传代数时。
未被发现的分化 一些程度的分化可能不会被常规显微镜检查检测到,因此常规的ES细胞传代是必需的。对于ES细胞分化的详细评估,推荐使用EMD Millipore的ES细胞鉴定试剂盒或碱性磷酸酶检测试剂盒(见第XXVII部分)。 关于使用RESGRO™培养基去除细胞系内分化的ES细胞的信息,请参阅本手册的第XXII部分。
ES细胞传代数 一般来说,最好的嵌合体是由低传代数的ES细胞产生的。如果细胞系培养的传代次数很多,建议使用较低传代的冻存细胞。
显微注射的ES细胞数量
microinjected
大多数ES细胞系以约8-12个细胞/胚泡的比例进行显微注射。
显微注射前的时间 建议将ES细胞从组织培养板中移出后尽快进行显微注射,并且不要将它们放置在冰上或室温下过长时间。
ES细胞和小鼠品系的相容性 在任何显微注射或聚集过程之前,请检查胚胎品系和ES细胞的组合,因为已经报道某些品系是不相容的。

 

 培养基配方

PMEF 饲养细胞培养基
 

描述 % v/v 货号
EmbryoMax® DMEM, 500 毫升 N/A SLM-220-B
EmbryoMax® ES 细胞验证的胎牛血清 10% ES009-M
EmbryoMax®青霉素-链霉素 1% TMS-AB2-C
EmbryoMax®L-谷氨酰胺溶液(100x) 1% TMS-002-C

 


含有血清的小鼠ES细胞培养基
描述

描述 % v/v 货号
EmbryoMax® DMEM, 500 毫升 N/A SLM-220-B
EmbryoMax® ES 细胞验证的胎牛血清 10-15% ES009-M
EmbryoMax® 青霉素-链霉素 1% TMS-AB2-C
EmbryoMax® L-谷氨酰胺溶液(100x) 1% TMS-002-C
EmbryoMax® 核苷(100X) 1% ES-008-D
EmbryoMax® 非必需氨基酸(100x) 1% TMS-001-C
EmbryoMax® 2-巯基乙醇(100x) 1% ES-007-E
ESGRO® mLIF 培养基添加剂 1000 units/mL ESG1107

 

 

 材料