解决方案:应对低丰度蛋白挑战

在Western Blot整个流程中,在以下关键步骤进行改善,可以事半功倍地提高低丰度蛋白的检测成功率。

样本制备:提高目标蛋白的丰度

内源和外源蛋白酶是造成蛋白降解的最大风险,所以制备蛋白第一要务是在抽提时添加蛋白酶抑制剂混合物(如果是磷酸化蛋白检测则同时需要加上磷酸酶抑制剂混合物)。防止蛋白降解,不仅能提高检测成功率,更能避免蛋白部分降解带来的杂带,使数据可信度和重现性更好。天然组织材料中蛋白成分复杂,丰度跨度大,而且以高丰度蛋白为主,为了提高低丰度蛋白的得率和相对含量,可以采用三类方案:高丰度蛋白去除:体液样本(如血清/血浆、腹水、脑脊液等)中IgG和白蛋白去除后,其它低丰度蛋白相当于富集了10倍以上,检测成功率显著提升分部富集:按照目的蛋白在组织/细胞中的分布特点进行组分富集,例如核蛋白、(跨)膜蛋白、骨架蛋白等,减少其它蛋白干扰,降低蛋白复杂程度IP/coIP:通过外源克隆重组表达或抗体亲和富集抗原,可以特异性地提高目的蛋白的丰度,同时减少背景,高品质的标签蛋白纯化树脂和磁珠以及Protein A/G是这类操作的关键

    

高效且重现性好地从血清样品中去除白蛋白/IgG

用ProteoExtract®白蛋白/IgG去除试剂盒(目录号122642)处理35μl人血清,每组分取15μg蛋白,经SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后经光密度分析可知,使用本试剂盒可以去除样品中88%±5%以上的血清白蛋白及90%±4%的IgG。

    

S-PEK(目录号539790)分部抽提的四个亚细胞组分经分析证明各有特征性的蛋白

A:选择性标志蛋白免疫印迹结果证明哺乳动物组织培养细胞各亚细胞蛋白质组分80%以上能够有效分离。为检测c-fos,电泳前蛋白进行免疫沉淀。

B:S-PEK抽提贴壁培养组织细胞各亚细胞蛋白组分,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证明,各组分都有特征性的蛋白。各组分如下:F1,细胞质组分;F2,细胞膜和细胞器组分;F3,可溶的核组分;F4,细胞骨架组分

    

FLAG®/HA标签蛋白的IP及WB检测

 

FLAG和HA都是非常小的标签,常被用来做融合蛋白表达,以在细胞环境中研究目的蛋白复合物或蛋白间相互作用,却对研究对象的干扰降到最低。FLAG标签蛋白的IP最常用磁珠(目录号M8823),HA的纯化多采用亲和琼脂糖(目录号A2095),如果FLAG和HA串联纯化,则推荐采用试剂盒TP0010。

    

目录号 产品类别 产品描述
122642-1KIT 高丰度蛋白去除试剂盒 ProteoExtract® Albumin/IgG remove kit
539790 亚细胞蛋白质组抽提试剂盒 ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit
71772-3 跨膜蛋白抽提试剂盒 ProteoExtract® Transmembrane extraction kit
FLAGIPT1 FLAG免疫沉淀试剂盒 FLAG Immunoprecipitation Kit

*国内现货

    

高效转印

PVDF膜作为转印膜在上世纪80年代被Millipore开发出来,并在Western Blot中替代NC膜已经有很长的历史了,其中一个重要的原因就是PVDF膜的载量远远高于NC膜,例如品质好的Millipore NC膜蛋白载量可以达到BSA 160 μg/cm2,而0.45μm的Immobilon®-P载量为BSA215 μg/cm2, 0.2μm的Immobilon®-PSQ蛋白载量更达到340 μg/cm2。更高的蛋白载量,使低丰度蛋白有更多的机会被印迹到转印膜上从而提高了检测成功率。需要注意的是,即使同为0.2μm孔径的转印膜,其它品牌市售产品的载量与Millipore的Immobilon-PSQ还是有着显著差异。

  • 采用更好品质的转印膜有助于稳定获得WB数据,提高重现性,并在数据之间有更好的可比性

  • 高载量Immobilon®-PSQ PVDF转印膜是低丰度蛋白检测的首选

  • 高丰度蛋白检测推荐经典的Immobilon®-P PVDF转印膜,减少高背景困扰

免疫信号增强和超敏底物

Millipore在我们成立350年之际集中推出了两款WB突破性产品,极大地改善了低丰度蛋白的检测成功率。

Immobilon® enhancer免疫信号增强试剂:替代传统的蛋白类封闭剂可以减少背景,并通过促进抗体与抗原特异性结合而显著减少抗体用量,增强信号

Immobilon®-ECL Ultra超敏底物:

• 为低fg级超高灵敏度的HRP化学发光底物,用于极富挑战的低丰度蛋白的检测;

• 常规检测也可以大幅度节约宝贵的抗体

以Immobilon免疫信号增强试剂替代普通封闭剂和抗体稀释液,轻松提高低丰度蛋白检测信号,效果稳定、显著。

   

目录号 产品描述 产品类别
IEVH00005 Immobilon®-E transient hydrophilic PVDF, 26.5cmx1.875 m(提供中文说明书) 即用型PVDF转印膜
IPVH00005 Immobilon®-P PVDF 26.5cmx1.875m, 0.45μm PVDF转印膜
ISEQ00005 Immobilon®-PSQ, 26.5cmx1.875m, 0.2μm 小蛋白专用PVDF转印膜
WBSH0500 Immobilon® Signal Enhancer 500ml(提供中文说明书) 免疫信号增强试剂
WBKLS0500 Immobilon® Chemilum HRP Substrate 500ml 高敏HRP底物
WBULS0100 Immobilon® ECL Ultra HRP Substrate 100ml(提供中文说明书) 超敏HRP底物