功能基因组学和RNAi

何为锌指核酸酶(ZFN)技术?

锌指核酸酶(ZFNs)是一类生物工程DNA结合蛋白,通过在用户指定DNA位点产生双链断裂而对基因组进行靶向编辑。

锌指核酸酶:高度特异的基因组剪刀

Zinc Finger Nucleases: Highly-specific Genomic Scissors Image

图1:每个锌指核酸酶(ZFN)由两个功能结构域组成:a.)一个DNA结合结构域:由一个双指模块链组成,每个模块识别一个独特的六聚体(6bp)DNA序列,双指模块拼接在一起形成一个锌指蛋白,每个蛋白具有≥24 bp的特异性;b.)由Fok I的核酸酶结构域组成的DNA切割结构域:当DNA结合结构域和DNA切割结构域融合在一起时,产生高度特异性的“基因组剪刀”。


双链断裂可刺激细胞的天然DNA修复过程,即同源重组和非同源末端连接(Non-Homologous End Joining,NHEJ), 这对于位点特异性诱变十分重要。通过现有技术方法,此过程可用于精确靶向的基因组编辑,制造具有靶向基因缺失,整合或修饰的细胞系。

优势

  • 快速破坏或整合到基因组任何位点
  • 突变永久可遗传
  • 适用于哺乳动物体细胞各种类型
  • 单个转染实验诱导基因编辑
  • 敲除或敲入细胞系实验周期短至两个月
  • 群体中1-20%的克隆发生基因单编辑或双编辑
  • 筛选时不需要抗生素

目标应用

  • 功能基因组学/靶标验证
    • 创建多个细胞系中的基因敲除
    • 彻底敲除不服从RNAi的基因
  • 细胞水平筛选
    • 创建敲入启动子,融合标签或报道基因的细胞系
  • 细胞系优化
    • 创建高表达蛋白质或抗体的细胞系

锌指核酸酶介导的靶向基因组编辑

ZFN-Mediated Targeted Genome Editing Image

图2:锌指核酸酶介导的基因组编辑发生在细胞核中,通过转染,电穿孔或病毒将靶向用户目的基因的锌指核酸酶对传送至亲代细胞系。