手性色谱常问问题


 手性和手性色谱

什么是手性?

手性属于立体化学学科,它是关于分子三维结构的研究。手性化合物具有光学活性,这意味着取决于它们的配置,它们将偏振光向左或向右旋转。这个词来自希腊词干“chir-”,意思是手,指惯用手。手性分子就像左手和右手 — 它们是镜像。没有旋转量可以使两个图像或分子重叠。手性化合物旋转偏振光平面;其作用程度称为特异性旋转或旋光。

异构体有哪些类型?

异构体是具有相同化学分子式的分子,并且在原子之间通常具有相同类型的键,但其中原子排列却不同。这个词来自希腊语“isomeres”,意思是拥有相同的份额。异构体可以是结构性的或空间性的(立体异构体)。在结构异构体中,原子和官能团以不同方式连接在一起。例如,戊烷可以以三种结构异构体存在:正戊烷、异戊烷和新戊烷;邻位、间位和对位取代的化合物也是结构异构体。立体异构体(空间异构体)是相同物质的异构体,只是其原子的空间排列不同。化合物可存在的最大立体异构体个数为2n,其中n是手性中心的数目。手性中心是与四个不同基团键合的原子,通常为C。旋转偏振光平面方向不同的立体异构体被称为光学活性或手性,它们的异构体被称为对映异构体。所有对映异构体均为立体异构体,但并非所有立体异构体均为对映异构体。对映异构体旋转偏振光平面 — 一个对映异构体向左,另一个对映异构体向右。对映异构体是不可重叠的镜像。非对映体(或非对映异构体)是具有多于一个手性中心的分子。如果非对映异构体是镜像,则它们可以是对映异构体。如果不是,它们只是非对映异构体,其化学性质不同,并且可用常规方法分离。端基差向异构体是非对映异构体,其仅在第一个C原子的构型上不同。差向异构体是非对映异构体,其仅在第二个C原子的构型上不同。内消旋化合物具有两个手性中心,但不具有光学活性,因为由一个中心引起的旋转完全被另一个中心的旋转所抵消。有一个通过分子中心的对称平面;分子的一半是另一半的镜像。

什么是外消旋化合物?

外消旋化是对映异构体纯度的丧失。从单一对映异构体形式开始,但最终得到的是对映异构体的混合物(外消旋物)。可以由高温或生物转化造成。
外消旋混合物是等比例的(+)和( - )对映异构体的混合物。取决于化合物的类型,被赋予+ / -、R / S、d / l或D / L等标识。外消旋混合物是无光学活性的。

用什么命名法来区分对映异构体?

(+)和(-)是根据分子旋转偏振光的方向来进行实验验证的。(+)是顺时针旋转,(-)是逆时针旋转。
(R)和(S)(右和左)则基于C周围的优先基团的方向,最低优先级的基团指向远离。
在(d)和(l)、(D)和(L)命名符号中,d或D代表“dextro”,意思是“右”,是指顺时针旋转,l或L代表“levo”,意思是“左”,是指逆时针旋转。氨基酸、糖和相关化合物仍以D、L命名。该体系由Emil Fisher发明,命名甘油醛的构型。他任意地指定了甘油醛的+异构体为D异构体。d 和 l 命名是指平面偏振光(钠d系列)的旋转。如果光向右旋转,则命名为“d”或(+)。这样的命名存在一些问题,因为D-谷氨酸对偏振光的旋转方向实际是 l 或(-)。使用这些符号时必须小心,因为只有通过实验确定它们实际旋转(+或-)后,才能把他们关联起来。

为什么各家公司都关心其化合物的手性纯度?

除了不同的对映异构体之间的安全性和有效性存在差异外,还有其他一些关于光学纯化合物的论点。(1)剂量较低。如果产品含有不需要的或无活性的对映异构体,那么它们需要的剂量是仅含纯活性对映异构体时所需剂量的两倍。(2)不存在不需要的对映异构体对所需活性的干扰。在许多情况下,不需要的对映异构体具有不同的生物活性,并且会干扰预期的对映异构体的性能。(3)节省测试时间。如果产品含有一种以上的对映异构体,那么需要检查每种异构体和外消旋物的生物活性,以检查它们的合作效应。这个工作量比测试纯对映异构体要多三倍!除了制药行业以外,其他行业(例如农业化学)的情况亦是如此。这具有环境方面的复杂性,因为它会影响施用于作物的化学品总量。

如何获得纯对映异构体?

由于许多化合物可以以两种或更多种对映异构体存在,那么化学家如何获得纯对映异构体呢?通常,采用两种技术:合成技术和合成后技术。(1)合成。通过使用手性纯的原料(合成子)、不对称合成、化学催化或生物催化来避免外消旋混合物。(2)合成后技术使用色谱法。手性固定相(HPLC和SFC)可以将外消旋混合物分离成单独的异构体,并且可以按比例放大至制备规模。可以使用手性衍生化试剂或通过使用手性流动相添加剂将对映异构体转化为非对映异构体,然后使用常规HPLC或GC分离。然而,这种方法通常不在工业中使用,因为它需要手性纯的衍生化试剂,并且必须与每种对映异构体的反应速率相同。如果可以进行模拟移动床制备(SMB),成本会下降。现在有一些新的酶技术(连续)可用,这些技术将不需要的异构体转化回外消旋物,以作进一步制备。用于工艺规模运作的最流行的分解外消旋混合物的方法仍然是非对映异构体盐的结晶。

什么是“e/e”比率?

“e/e”是指化合物中一种对映异构体与另一种对映异构体的比例。例如,在制备型手性HPLC中,“纯”对映异构体可以是98% e/e。

手性色谱如何工作?

相同化合物的对映异构体具有相同的物理性质。它们的区别仅在于:(1)它们旋转偏振光的方向,(2)它们的生物活性(某些),以及(3)它们与其他手性分子的相互作用,如色谱分离中的手性固定相(CSP)。利用最后一点来实际分离和量化对映异构体是手性色谱的功能。

对于手性化合物,使用什么检测器?

HPLC检测器特别适用于检测和测量手性化合物。这些检测器(在线和离线)用于测量对映异构体含量的峰值或纯化样品的对映异构体含量。
有两种类型的手性检测器可用:偏光计和圆二色性光谱仪。

什么是极性离子模式(PIM)?

这是CHIROBIOTIC CSP独有的流动相系统。它被定义为含有可溶性盐(例如乙酸铵)的极性有机溶剂(例如甲醇)。作为Astec CHIROBIOTIC CSP的一个重要特性,这种新颖且用途非常广泛的极性离子模式很受欢迎,因为它的流动相是含有挥发性添加剂的极性有机溶剂,非常适合制备型应用和LC-MS应用。与正相分离相比,极性离子模式具有速度、效率和灵敏度优势,这些都是LC-MS的宝贵资产。

什么是极性有机模式(POM)?

流动相是极性有机溶剂或溶剂混合物。极性中性分析物的对映异构体已在Astec CHIROBIOTIC上用极性有机模式反应混合物成功分离,即使在吡啶中,也可在此模式下在Astec CHIROBIOTIC上运行。

为什么POM可用于手性HPLC和LC / MS?

当处理在非极性正相流动相中难溶的化合物时,POM的好处就显现出来。对于制备型手性应用,溶解度尤为重要;每次注射的分析物浓度影响吞吐量。POM流动相还与质谱兼容,因为它们使用甲醇基洗脱液以及一些酸和碱或挥发性铵盐作为添加剂。由于灵敏度较高,POM基线通常比正相基线噪声更小。POM流动相中的柱和系统平衡也非常快,并且没有记忆效应。

哪些类型的CSP可以使用POM?

Armstrong在1990年代早期(1-3)首次描述了POM对于基于天然和衍生化环糊精的CSP(例如Astec CYCLOBOND)的效应。然而,任何可以通过氢键机制与溶质相互作用的CSP都可以使用POM。这些CSP包括环糊精、以及大环糖肽(例如Astec CHIROBIOTIC)和多糖(例如Astec Cellulose DMP)。

流行的纤维素CSP可以使用POM吗?

是的! 虽然基于多糖的相(纤维素和直链淀粉)已经在正相和SFC系统中证明了它们的价值,但我们发现它们对POM流动相中的外消旋化合物具有良好的选择性。

POM是否可以替代正相?

与NP模式相比,POM上的分离可以更有效,分辨率更高。虽然这非常依赖于化合物,但如果需要改善溶解度、灵敏度或仪器兼容性,可以详细了解一下POM。图1图2显示了正相和POM系统中Astec纤维素DMP(3,5-二苯基氨基甲酸酯衍生的纤维素)上的抗抑郁剂米安色林和Tröger碱。请注意,在这两种情况下,POM分离都具有差不多的保留,但分辨率更高,峰更清晰。
 

图1. Astec纤维素DMP上NP与POM的比较(米安色林)

柱:Astec纤维素DMP,15 cm x 4.6 mm I.D.,5 μm颗粒(产品编号:51098AST

流动相:见图
流速:0.5 mL/min
检测器 UV,230 nm
样品:米安色林,2 mg/mL

图2. Astec纤维素DMP上NP与POM的比较(Tröger碱)

柱:Astec纤维素DMP,15 cm x 4.6 mm I.D.,5 μm颗粒(产品编号:51098AST

流动相:见图
流速:0.5 mL/min
检测器 UV,230 nm
样品:Tröger碱,2 mg/mL

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 手性HPLC柱的选择和筛选

如何选择手性柱?

可以查询您的应用是否可以在我们的应用数据库中找到或者已在文献中发表。搜索我们的网站,或联系我们的技术服务团队。但是,如果您有一种新化合物,则必须筛选色谱柱。您可以查旬是否有关于结构相关化合物的已发表方法,但结构相似性并不能保证手性固定相上的相似行为。最有效的方法是致电我们的手性服务团队。我们完全有能力进行色谱柱筛选、方法优化和纯化服务。如果您想自己完成这项工作,请选择HPLC、SFC或GC。然后,我们可以指导您选择适用于您的筛选方案和系统的色谱柱。

应该采用什么方法来筛选手性柱

即使是专家也需要筛选色谱柱。没有可靠的方法来选择只基于分析物结构的手性柱。我们的手性服务实验室不断尝试提高手性柱筛选方案效率的方法。目前,在结构多样化的32种化合物筛选组中实现了94%的成功率(表1)。表2中给出了我们的筛选方案以及成功或“命中”率。我们使用两种HPLC仪器,一个专用于正相(NP)操作,另一个专用于反相(RP)、极性离子模式(PIM) )和极性有机模式(POM)。多糖和合成聚合物CSP在NP和POM系统中筛选。而Astec CYCLOBOND CSP则在POM和RP中筛选。Astec CHIROBIOTIC CSP也在RP模式下筛选,但在PIM中最有用。PIM是CHIROBIOTIC独有的,对极性和离子化合物的对映异构体解析非常具有价值。当我们遇到具有伯胺基团(特别是在手性中心或其附近的基团)的分析物时,我们使用第三个NP和第三个POM移动系统并筛选三个环果聚糖(cyclofructan) CSP。我们筛选的所有色谱柱都非常耐用,无需是专用于单个流动相系统的。我们的筛选方案的简要说明旨在说明两点。首先,固定相选择性是影响对映异构体解析的最大因素。其次,具有广泛的流动相选择,从高极性离子和水性到非极性系统,使您能更加灵活地选择检测器,并获得提高分析物溶解度的手段。后者是制备手性分离的一个非常重要的考虑因素。

表1. 筛选实验中使用的化合物

 

精胺酸 芬氟拉明 5-甲基-5-苯海因 P-氯苯丙胺(Chloramphetamine)
巴氯芬 非诺洛芬 MDA(3,4-亚甲二氧基苯丙胺) 戊唑辛(Pentazocine)
苯偶姻 6-氟色氨酸 美托洛尔(Metoprolol) 丙环唑
安非他酮 氟西汀 米多君 普萘洛尔
扑尔敏 氟比洛芬 N-乙酰同型半胱氨酸硫代内酯 辛弗林
氯吡格雷 糠偶姻 诺氟西汀 硫辛酸
3,4-二氢苯基丙氨酸 酮咯酸 去甲变肾上腺素 三唑醇
扁桃酸乙酯 扁桃酸 奥美拉唑 维拉帕米

 

表2. 利用CSP的选择性和流动相灵活性的筛选方案


点击放大)


您是否有应用数据库来搜索色谱柱和条件?

有!我们不断在我们的网站上添加手性应用。通常用谷歌即可搜索出我们的应用。但是您可以访问我们的网站,在搜索栏中输入化合物的名称(加上“对映异构体”可缩小搜索范围)。如果我们有应用,那么它会列在“分析应用”选项卡下。您还可以搜索我们的手性参考书目,那里有我们的色谱柱被科学文献引用的最新引用列表。或者,请浏览:sigma-aldrich.com/applications-search

我们是否可以根据已发表的关于另一种具有相似官能团的分析物的参考文献为我们的应用选择色谱柱?

结构相似性并不能保证手性固定相上的相似行为。如果找不到完全相配的化合物,则必须筛选色谱柱,或者致电我们的手性服务团队。如果您有酸性、碱性或中性分析物,我们的手性方法开发挂图在确提供了一些关于优化方法的指导。

什么特定的色谱柱和流动相能分离一组特定的对映异构体?

人们认为手性化学是直接、简单的,我们应该只能看到一种化合物并且知道什么会产生对映异构体选择性。然而,正如您所知,通常情况并非如此。如果我们一个特定分析物没有任何应用,我们通常建议使用手性筛选。

在整个手性列表中,哪个是最佳色谱柱可以用于多个应用?

对于HPLC,我们推荐使用纤维素柱(Astec纤维素DMP或Kromasil CelluCoat)、Astec CHIROBIOTIC V2、T和TAG。这4种CSP可在不同的流动相条件下分离绝大多数对映异构体。对于GC,我们建议使用Astec CHIRALDEX G-TA、G-DP、B-DM和Supelcoß-Dex 110或120。

您的哪个色谱柱等同于{特定竞争对手的色谱柱}?

不幸的是,很少有手性柱可以互换。手性保留机制很复杂。

您是否有任何与Daicel柱匹配的等效柱?

所有手性柱都不同。然而,在选择性方面,我们提供Astec纤维素DMP和Kromasil® CelluCoat™(仅在美国和加拿大提供),其性能与CHIRALCEL® OD-H和基于DMPC衍生的纤维素技术的相相似。

对于CHIROBIOTIC和CYCLOBOND(以及我们的任何柱),我如何能成功地将这些柱添加到我当前的柱筛选中,以便进行快速、简便的方法开发?

我们提供方法开发图表,该图直观、清晰地显示了如何将Astec CSP纳入您的筛选方案,以及如何开发和优化方法。关于方法开发和这些相的优化,请参阅CHIROBIOTICCYCLOBOND的常问问题部分。

我有兴趣将您的色谱柱添加到我的手性筛选中,但如果我的系统设置为正相而不是反相,我该怎么办呢?

对于正相和SFC,使用我们纤维素柱(Astec纤维素DMP、Kromasil Cellucoat)、Astec P-CAP、P-CAP-DP、Astec CYCLOBOND I 2000 DMP和DNP。还要考虑极性离子模式(PIM)和极性/离子化合物的反相模式的优势,并优化分析物溶解度和LC-MS兼容性。

您推荐哪些色谱柱用于手性SFC(超临界流体色谱)?

可以在正相中运行的任何柱都可以在SFC中运行。对于正相和SFC,使用我们纤维素柱(Astec纤维素DMP、Kromasil Cellucoat)、Astec P-CAP、P-CAP-DP、Astec CYCLOBOND I 2000 DMP和DNP。

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 Astec CHIROBIOTIC手性HPLC

什么是Astec CHIROBIOTIC系列?

Astec CHIROBIOTIC系列由Daniel W. Armstrong教授发明,包含基于大环糖肽的高度对映选择性的CSP,所述大环糖肽通过多个共价键与高纯度二氧化硅颗粒结合。Astec CHIROBIOTIC CSP可灵活选择水相和非水相流动相,是中性、极性和离子化合物分析型和制备型分离的理想选择。

Astec CHIROBIOTIC CSP如何分离对映异构体?

Astec CHIROBIOTIC CSP提供六种不同类型的分子相互作用:离子、H键、π-π、偶极子、疏水性和立体。它们还具有多个包含位点,这些位点基于分析物的分子形状影响选择性。通过改变流动相以利用各种相互作用的类型和相对强度来实现对对映异构体分辨率的优化。

Astec CHIROBIOTIC CSP有何不同?

各种Astec CHIROBIOTIC相具有稳健性、流动相选择灵活性、离子相互作用、与极性化合物和LC-MS的兼容性、以及制备规模可缩放性等优点。然而,Astec CHIROBIOTIC CSP的选择性不同,主要是因为它们的相互作用位点的数量和类型不同,以及键合的大环糖肽中离子位点的数量、类型和可及性。

是什么让Astec CHIROBIOTIC CSP独一无二?

就其形态、分子组成、以及与二氧化硅表面的多个共价键而言,键合的大环糖肽本身使Astec CHIROBIOTIC CSP具有独特性,并使其具有显著和有价值的优势,超过其他CSP。Astec CHIROBIOTIC CSP的真正差异化特征是存在离子相互作用。这些相互作用是Astec CHIROBIOTIC CSP独有的,并且在很大程度上使它们在水性和非水性溶剂中对极性和可电​​离分析物具有理想的保留特性。

不同的CHIROBIOTIC CSP之间有什么区别?

CHIROBIOTIC CSP基于不同的大环糖肽(微生物来源的天然产物)。目前,我们提供4种:替考拉宁、万古霉素、瑞斯托菌素和替考拉宁糖苷配基。每种在其提供的分子相互作用类型和手性中心数量方面都是独一无二的。它们具有非常不同的对映选择性,但它们都具有离子相互作用和在水性反相、极性离子和极性有机流动相系统中操作的能力。

CHIROBIOTIC V与V2、T与T2之间有什么区别?

Astec CHIROBIOTIC V和T在其键合化学上分别与V2和T2不同,这使得它们对某些类别的分析物具有不同的选择性和制备能力。

您推荐使用什么样的CHIROBIOTIC筛选方案?

极性离子(PIM)— 甲醇 / 乙酸 / TEA(100:0.1:0.1 v/v/v)。通过改变酸碱比(每种最高可达1%)、改变酸或碱的类型、或添加挥发性盐(测试不同的铵盐)进行优化。
反相(RP) — 甲醇或乙腈 / 20 mM乙酸铵,pH 5(30:70)。通过改变有机改性剂的%或类型、调节pH、缓冲剂类型、离子强度进行优化。
极性有机物(POM)— 乙醇。通过使用其他极性有机溶剂或混合物进行优化。
正相(NP)— 乙醇 / 庚烷(30:70)。通过改变极性改性剂的%、或改变两种溶剂来优化。

PIM中不同盐的作用是什么?

在极性离子模式(PIM)中,DEA或氢氧化铵可代替TEA,但选择性将不同。

如何使用酸碱比调整对映选择性和保留?

CHIROBIOTIC CSP具有离子官能团,是极性离子模式的理想选择,极性离子模式被定义为极性有机溶剂(甲醇或乙腈),其中添加了可溶性盐、酸、碱或这些添加剂的组合。极性离子模式可用于可电离化合物,其中良好的起始流动相为0.1% TEA / 0.1%乙酸的甲醇溶液。在LC-MS情况中,使用挥发性铵盐,如甲酸铵或三氟乙酸铵。当使用极性离子模式时,方法的开发和优化涉及调节酸(通常为乙酸)与碱(通常为TEA)的比例,以调节选择性和保留。该比例取决于对映异构体的pKa和其他因素。对于碱性分析物,使用较高比例的酸,而对于酸性分析物,使用较高比例的碱。酸碱比可以为4:1至1:4。1:1的比例用于筛选目的。如果保留时间仍然太短,使用低浓度的TEAA(0.1%),或者用高达50%的乙腈代替甲醇,将会降低流动相强度。但是,如果化合物是中性且不太极性,则在极性离子条件下几乎没有或完全没有保留,应该尝试不同的流动相系统,例如正相。

在极性离子模式(PIM)中,最好什么时候向流动相中加水?

CHIROBIOTIC相中存在的离子官能团,意味着您可以使用极性添加剂(盐、水)来改进方法的开发、方法的再现性和色谱柱性能。在Astec CHIROBIOTIC色谱柱上开发可电离分析物(酸、碱、两性离子)的方法时,极性离子模式(PIM)是一个很好的起点。极性离子模式流动相是含有0.1% w/v甲酸铵的甲醇。改变NH4OH:甲酸比率,或尝试其他铵盐(例如三氟乙酸盐或乙酸盐)以进行优化。在LC-MS应用中,可以在流动相中加入少量水(3-5%),以提高方法的灵敏度和再现性。加入水有助于提高盐在甲醇中的溶解度。

如何优化LC/MS的手性分离?

对于PIM模式中的CHIROBIOTIC分离,使用挥发性盐(例如乙酸铵、甲酸铵、TFA铵)。对于POM模式下的CYCLOBOND分离,用氢氧化铵代替TEA,将浓度降低50-75%。对于反相(RP)模式的两种类型的色谱柱,使用醋酸铵或甲酸铵。

如何提高极性离子(PIM)方法的稳固性和可重复性?

极性和离子对映异构体的分辨率是Astec CHIROBIOTIC CSP的独特而有价值的特征。这些分离的流动相非常简单:含有挥发性酸和碱或其相应盐的极性有机溶剂,如甲醇或乙腈。改变酸和碱的浓度或酸碱比例可优化保留和选择性。然而,当这些添加剂以高浓度使用时,或者当添加剂在溶剂中的溶解度有限时,可能发生保留时间变化和平衡缓慢。我们发现向流动相中加入少量水会增加添加剂的溶解度,缩短平衡时间,并在需要时提高保留时间的稳定性。通常,向甲醇流动相中加入5-10% v/v水,足以产生稳定的保留和保持对映选择性,同时还保持相同的离子机制。

如何在极性离子模式(PIM)分离中稳定保留时间?

如果保留时间不够稳定,对于某些PIM应用,非常必要的做法是将5%的水添加到甲醇 / 0.1% ATFA中。
 

如何维护保养CHIROBIOTIC色谱柱?

CHIROBIOTIC相中存在的离子官能团,意味着您可以使用极性添加剂(盐、水)来改进方法的开发、方法的再现性和色谱柱性能。为了使您的色谱柱保持最佳性能,并在操作过程中最大限度地延长使用寿命和提高方法的再现性,基于大环抗生素的Astec CHIROBIOTIC色谱柱应每周清洗一次,使用20倍柱体积的(50:50)乙腈:50 mM乙酸铵流动相,然后用20倍柱体积的100%甲醇清洗。在储存色谱柱之前,建议使用5-甲基-5-苯基乙内酰脲(产品编号:40095-U)与甲醇作为流动相进行快速QA测试。有关完整详细信息,请参阅色谱柱随附的QA测试报告。

如何重新测试CHIROBIOTIC色谱柱?

为确保CHIROBIOTIC色谱柱的选择性性能,应定期用100%甲醇流动相中添加5-甲基-5-苯基乙内酰脲(产品编号:40095-U)测试柱。

CHIROBIOTIC色谱柱的最佳储存溶剂是什么?

乙腈或甲醇适用于短期储存,长期储存(> 24小时)建议使用异丙醇。

如何确定哪种色谱柱最适合分离氨基酸?

大多数氨基酸是手性的,L-型在自然界中占主导地位。研究D-氨基酸和D与L-型的比例有各种原因,包括药物研究和探索它们的外星起源。Astec手性HPLC和GC固定相特别适用于手性氨基酸分离,包括天然氨基酸及其N-封闭衍生物。CHIROBIOTIC CSP具有离子官能团,因此可以对具有离子或可电离基团的化合物进行手性鉴别。它们还在MS兼容的流动相中操作,其中氨基酸可自由溶解。其他相,尤其是Astec CLC和各种CYCLBOND化学品,也已发现可用于氨基酸对映异构体分离。有关选择HPLC CSP进行手性氨基酸分离的一般指导,请参阅我们的决策树。



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 Astec CYCLOBOND手性HPLC

什么是CYCLOBOND?

多功能和独特的Astec CYCLOBOND™CSP(手性固定相)是一系列与高纯度硅胶结合的衍生化和未衍生化的β-和γ-环糊精。由Daniel W. Armstrong教授发明并于1984年推向市场,它们通过HPLC(手性和非手性)广泛用于异构体分离。Astec CYCLOBOND与其他CSP互补,包括基于多糖的CSP,基于大环糖肽的AstecCHIROBIOTIC® CSP,以及基于胺共聚物的Astec P-CAP™和Astec P-CAP-DP。

什么是环糊精?

环糊精的产生:部分降解淀粉,然后将葡萄糖单元酶促偶联成不同分子大小、具有均匀的环状结构的结晶。D(+)-葡萄糖残基通过α-(1,4)糖苷键彼此键合。葡萄糖残基的椅形配置使得环形“桶”在一端变窄。三种高度表征的环糊精是α、β和γ环糊精,它们分别含有六个、七个和八个葡萄糖单元。
 因为每个葡萄糖残基具有五个手性中心,所以环糊精本身是手性结构。例如,β-环糊精具有35个手性中心。

基于环糊精的CSP(包括CYCLOBOND)如何分离对映异构体?

环糊精的结构和化学性质都有助于对映异构体分离。环形环糊精结构具有由2-、3-和6-位羟基(OH)基团产生的亲水外表面。内部环糊精腔由葡萄糖氧和亚甲基氢组成,这使其具有非极性(疏水)特性。导致手性分离的化学相互作用发生在环糊精环的外表面和内表面上。保留和手性识别的最重要考虑因素是分析物与环糊精腔的适当拟合。该拟合是分子大小和分析物的形状相对于环糊精腔的函数。
 因此,在环糊精的手性分离中存在两种基本机制:在内腔表面上发生的那些(包合物络合)和在环糊精环形物的外表面上发生的那些(表面相互作用)。

什么是“包合物络合”?

在反相模式(含有甲醇或乙腈与水的流动相)中,基于环糊精的CSP的许多分离的基础是称为包合物络合的现象。如果分析物可以拟合环糊精腔并且流动相条件是有利的,则可以发生包合物络合机制。正是由于包合物络合,反相是CYCLOBOND CSP上非常成功的模式。手性鉴别需要三个相互作用点,包合物络合提供三种相互作用中的一种。包合物络合机制归因于非极性分子或分子区段对非极性环糊精腔的吸引,其对结构差异非常敏感。当分析物具有芳族基团时,由于芳族亚甲基基团与环糊精环形内表面上的葡糖苷氧之间的电子共享,空腔中的取向是选择性的。通过溶质官能团与环糊精环的2-和3-位仲醇羟基基团的相互作用来完成该机制。

是什么让Astec CYCLOBOND CSP独一无二?

CYCLOBOND CSP通过环糊精腔和各种衍生物的官能团提供的多种手性机制提供独特的手性选择性。CYCLOBOND CSP具有化学稳定性,使用寿命长,流动相选择广泛,效率高。

在Astec CYCLOBOND CSP上分离出哪些类型的对映异构体?

通常,取代的苯基、萘基和联苯环可以在基于β-环糊精的CYCLOBOND I 2000及其衍生物上分离。具有杂环的分子通常也在这些相上分离。具有三至五个环的分析物,包括类固醇,最好在基于g-环糊精的CYCLOBOND II及其衍生物上分离。在分析物的芳环上具有卤素、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐和羟基的对映异构体,通常在CYCLOBOND CSP上很好地分离。在CYCLOBOND上成功分解的还包括含有环外氢键官能团、顺式/反式和位置性异构体紧密相关的非手性分子、以及衍生的手性氨基酸的化合物。

您推荐使用什么样的CYCLOBOND筛选方案?

反相(RP) — 乙腈 / 20 mM乙酸铵,pH 5(30:70),或者甲醇 / 20mM乙酸铵,pH 5(20:80)。通过改变有机改性剂的%或类型、调节pH、缓冲剂类型、离子强度进行优化。
极性有机物(POM)— 乙腈 / 甲醇 / 乙酸 / TEA(95:5:0.1:0.1)。通过使用其他极性有机溶剂或混合物进行优化。改变酸碱比(每种最高可达1%)。请注意,在POM模式下,甲醇和乙腈在CYCLOBOND上显示出很大差异。
正相(NP)— 乙醇 / 庚烷(30:70)。通过改变极性改性剂的%、或改变两种溶剂来优化。

如何维护保养CYCLOBOND色谱柱?

每个柱用10倍于柱体积的乙醇冲洗,然后用HPLC级水冲洗。然后用10倍于柱体积的乙腈以低流速冲洗。与甲醇相比,乙醇从腔中置换物质的效率要高两倍。

CYCLOBOND色谱柱的最佳储存溶剂是什么?

乙腈适用于短期储存,长期储存(> 24小时)建议使用异丙醇。

如何重新测试CYCLOBOND色谱柱?

请参阅柱的QA报告、CYCLOBOND使用说明或联系技术服务了解测试程序。

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 制备型手性HPLC

如何在Astec手性HPLC柱上进行制备分离?

Astec CHIROBIOTIC在制备应用中的一个显著优势,是可以选择流动相来优化样品溶解度 — 这是一个关键的制备考虑因素。Astec CHIROBIOTIC色谱柱可用于所有制备型HPLC技术,包括洗脱和循环色谱、质量定向制备、SFC和模拟移动床(SMB)。规模放大是高度可预测的,因为在所有粒径上使用相同的键合相化学。多个共价键将Astec CHIROBIOTIC大环糖肽连接到二氧化硅表面,这意味着没有CSP配体会污染产品。Astec CHIROBIOTIC色谱柱的制备分离通常比其他CSP具有速度和效率优势。就载荷能力而言,25 cm x 21.2 mm色谱柱具有中到高的载量,每次注射从几毫克到超过300毫克。Astec CHIROBIOTIC的制备分离具有可再现性和可扩展性。

什么是SMB制备?

SMB(模拟移动床)是制备色谱的一种形式,其让多个柱同步工作,作为单个柱使用。SMB的吞吐量显著高于批量或单柱工作。 Astec CHIROBIOTIC CSP的质量,使其成为制备(包括SMB)的理想选择,具有出色的对映选择性,特别是对极性和离子化合物;流动相灵活,可最大限度地提高样品溶解度;可在所有流动相中操作,无记忆效应;大呑吐量柱效高,下游处理最少。CHIROBIOTIC CSP特别适用于SMB制备,其坚固性使其能够长期可靠地运行。用于SMB的新型Astec CHIROBIOTIC色谱柱的特点是,其粒径和色谱柱尺寸适用于大流速和高效率。一组8个柱的效率匹配在6% rsd以内。我们提供尺寸为25 cm x 4.6 mm I.D.和5 cm x 10 mm I.D.的单体柱,可用于方法开发和规模放大实验。

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 手性HPLC的提示和技巧

手性HPLC是否有任何流速方面的考虑因素?

由于大多数手性固定相非常复杂(密集键合、大分子),因此在van Deemter方程中它们具有高C项。这是对固定相传质的高抗性。因此,当高于最佳流速时,效率很快下降。对于对映异构体没有很好分离的临界分离,值得研究流速对分离的分辨率的影响。Van Deemter对反相、极性离子和极性有机模式的4.6 mm内径、5 μm颗粒CHIROBIOTIC T和V2色谱柱进行的研究表明,在0.15与0.2 mL/min之间的流速下可实现最大的峰效率。(线速度在0.2与0.3 mm/s之间;降低的线速度在0.61与0.81之间)。因此,降低超过标准的流速可以提高每个峰的效率,从而提高对映异构体的解析度。一旦在手性固定相上实现对映异构体选择性,可通过改变流动相组成、温度、和/或流速来改善对映异构体的分辨率。1.0 mL/min的流速在填充有5 μm颗粒的内径为4.6 mm的柱的方法开发过程中经常使用。对于方法优化,如果对映异构体已经分离,但未以1 mL/min完全解析,则将流速降至1.0 mL/min以下,可进一步提高分辨率。

温度对手性HPLC有何影响?

可以利用温度来改变手性固定相上的分离的对映选择性。温度的作用是溶质 / 流动相 / CSP相互作用之间非常复杂的热力学关系。温度的变化将改变由上述相互作用产生的溶质的热力学行为。有时,提高温度可以提高分辨率,有时降低温度会带来理想的改善。这种现象是不可预测的,因此温度为色谱工作者提供了另一种优化工具。

如何测量手性HPLC柱的空隙体积?

由于大多数手性固定相可能存在许多不同类型的相互作用,因此很难找到完全未保留的化合物。对于填充有传统多孔球形二氧化硅颗粒的HPLC柱,空隙体积的粗略估计约为柱体积的70%(0.7πr2 L)。对于25 cm x 4.6 mm色谱柱,该值约为3 mL。如果速度为1 mL/min,则T0为3分钟。

可以在手性HPLC中使用梯度洗脱吗?应该何时这样做?

其中手性配体与颗粒表面共价键合的HPLC相,如Astec CHIROBIOTIC、Astec CYCLOBOND、Astec P-CAP和P-CAP-DP,与梯度洗脱完全相容。但是何时可以在手性HPLC中使用梯度洗脱呢?首先,梯度可用于加速筛选过程,采用更通用的方法,涵盖更广泛的样本类型。其次,可以针对等度来优化用梯度检测的选择性。Astec CHIROBIOTIC和大多数CYCLOBOND相以反相模式运行,可以使用典型的RP型梯度(通过增加有机改性剂的%来提高溶剂强度)。另外,由于Astec CHIROBIOTIC的离子特性,它们还响应于离子强度的增加(增加可溶性盐添加剂的%,例如乙酸铵,0-0.2%)。使用梯度的第二个原因是在注入不纯的样品时保持清洁、未污染的色谱柱。可以运行梯度以从柱中去除强键合的基质成分。(请注意,建议进行CHIROBIOTIC相的再生/保养,以恢复推荐的离子特性,见常问问题“如何维护保养CHIROBIOTIC色谱柱?”。) 有关梯度洗脱是否适合您的样品和系统的更多讨论,请咨询我们的技术服务
 

关于将仪器从正相(NP)转换为反相(RP)然后转回,您有何建议?

最好的解决方案是为每种模式配备专用仪器。膨胀 / 收缩会造成密封件明显磨损。但是,如果您不能配备专用仪器,则请注意下列几点:

  1. 我们的常规做法是在进入水之前用大量IPA冲洗。在所有冲洗过程中,确保冲洗整个流体路径(泵、自动采样器、检测器)。
  2. 对于自动采样器,确保冲洗样品回路和其正常注射操作中涉及的任何其他流体路径 — 取决于自动采样器是外部回路设计还是内部回路设计,这部分冲洗工作可能会有很大差异。
  3. 作为所有洗涤的一部分,确保也洗涤注射针 — 可以通过完全地注射几次溶剂(当然是在没接色谱柱的情况下)。
  4. 在进入水之前,在IPA之后用甲醇(或乙醇)冲洗也是一个好主意。甲醇将比直接从IPA转向接水更快地冲洗出IPA。当然,所有这些操作都假定IPA可与系统所暴露的最弱NP溶剂混溶。
  5. 另一个转换方向(RP-> NP)亦是如此。
    将RP转换为NP(反之亦然)(请特别注意哪些可以做哪些不可以做):
    - 去除所有添加剂,先用100%异丙醇冲洗所有容器。
    - 异丙醇与所有常见溶剂完全混溶,它对两个方向的转换都是最安全的转换溶剂。
    - 使用低流量 — 约为正常值的一半,以避免由于过压而损坏柱。
    - 请勿常规地使用乙腈作为有机物 — 它比甲醇好,但不能与纯碳氢化合物完全混溶。
    - 请勿常规地使用甲醇作为有机物 — 它与许多正相条件不完全混溶。
    - 乙腈或甲醇可常规地用于从RP转换为HILIC(使用极性水性流动相的极性溶质的NP)和转回。
    - 在开始之前,检查是否与目标流动相混溶(使用小型外部容器),特别是如果未选择异丙醇。
    - 如果更换梯度仪器,请在所有管路中使用有机物,以确保从所有流体区域清除水或碳氢化合物。
    - 在转换期间监控压力和检测器信号,这是确认系统完全达到平衡的最佳方法。
    - 不完全混合表现为严重的探测器基线噪音或压力波动(不混溶溶剂的小球类似于气泡)。
    - 即使没有监测到基线,也要冲洗探测器和所有其他组件。
    - 通过运行梯度空白看是否存在可能表明不混溶溶剂泡的基线噪音。
    - 良好的色谱是最终的测试 — 先使用简单的标准测试混合物,然后逐渐朝着真实样品运行。
    - 转换的总时间可能会有所不同,但需要大约一个小时 — 转换太匆忙通常反而会减慢过程。
    - 不要指望使用折射率检测器进行快速转换 — 转换后它们的平衡速度极慢。

对手性痕量分析有哪些指导原则?

使用5% 20 mM磷酸铵(pH 3.1)/ 95%甲醇非常适用于痕量分析和C*附近带有COOH和NH两者的化合物。您还应该考虑洗脱顺序。应首先洗脱痕量对映异构体。还可考虑缩小柱的内径(2.1 mm或1 mm)。任何能提高效率的因素也会提高灵敏度。通常,最大的杠杆是流速:确保在柱尺寸相应的最佳流速下运行。在手性HPLC中,最佳流速可能非常慢。

如何优化LC/MS的手性分离?

对于PIM模式中的CHIROBIOTIC分离,使用挥发性盐(例如乙酸铵、甲酸铵、TFA铵)。对于POM模式下的CYCLOBOND分离,用氢氧化铵代替TEA,将浓度降低50-75%。对于反相(RP)模式的两种类型的色谱柱,使用醋酸铵或甲酸铵。

如何在生物分析型手性LC-MS中去除磷脂干扰?

Astec CHIROBIOTIC色谱柱可与HybridSPE™-PPT板配合使用,通过完全去除内源蛋白质和磷脂来增强灵敏度。

如何配制TEAA缓冲液?

0.1% TEAA(乙酸三乙胺)溶液通常用于反相(RP)和极性离子模式(PIM)流动相。对于RP,将TEA v/v加入水中,用乙酸滴定至所需pH。对于PIM流动相,我们使用100/0.1/0.1甲醇 / 乙酸 / TEA(v/v/v),通过将1 mL TEA和1 mL乙酸加入1 L甲醇中制备。

如何在极性离子模式(PIM)下稳定保留时间?

如果保留时间不够稳定,对于某些PIM应用,非常必要的做法是将5%的水添加到甲醇 / 0.1% ATFA中。

如何提高极性离子(PIM)方法的稳固性和可重复性?

极性和离子对映异构体的分辨率是Astec CHIROBIOTIC CSP的独特而有价值的特征。这些分离的流动相非常简单:含有挥发性酸和碱或其相应盐的极性有机溶剂,如甲醇或乙腈。改变酸和碱的浓度或酸碱比例可优化保留和选择性。然而,当这些添加剂以高浓度使用时,或者当添加剂在溶剂中的溶解度有限时,可能发生保留时间变化和平衡缓慢。我们发现向流动相中加入少量水会增加添加剂的溶解度,缩短平衡时间,并在需要时提高保留时间的稳定性。通常,向甲醇流动相中加入5-10% v/v水,足以产生稳定的保留和保持对映选择性,同时还保持相同的离子机制。

如何在极性离子模式(PIM)分离中稳定保留时间?

如果保留时间不够稳定,对于某些PIM应用,非常必要的做法是将5%的水添加到甲醇 / 0.1% ATFA中。

如何使用酸碱比调整对映选择性和保留?

CHIROBIOTIC CSP具有离子官能团,是极性离子模式的理想选择,极性离子模式被定义为极性有机溶剂(甲醇或乙腈),其中添加了可溶性盐、酸、碱或这些添加剂的组合。极性离子模式可用于可电离化合物,其中良好的起始流动相为0.1% TEA / 0.1%乙酸的甲醇溶液。在LC-MS情况中,使用挥发性铵盐,如甲酸铵或三氟乙酸铵。当使用极性离子模式时,方法的开发和优化涉及调节酸(通常为乙酸)与碱(通常为TEA)的比例,以调节选择性和保留。该比例取决于对映异构体的pKa和其他因素。对于碱性分析物,使用较高比例的酸,而对于酸性分析物,使用较高比例的碱。酸碱比可以为4:1至1:4。1:1的比例用于筛选目的。如果保留时间仍然太短,使用低浓度的TEAA(0.1%),或者用高达50%的乙腈代替甲醇,将会降低流动相强度。但是,如果化合物是中性且不太极性,则在极性离子条件下几乎没有或完全没有保留,应该尝试不同的流动相系统,例如正相。

在极性离子模式(PIM)中,最好什么时候向流动相中加水?

CHIROBIOTIC相中存在的离子官能团,意味着您可以使用极性添加剂(盐、水)来改进方法的开发、方法的再现性和色谱柱性能。在Astec CHIROBIOTIC色谱柱上开发可电离分析物(酸、碱、两性离子)的方法时,极性离子模式(PIM)是一个很好的起点。极性离子模式流动相是含有0.1% w/v甲酸铵的甲醇。改变NH4OH:甲酸比率,或尝试其他铵盐(例如三氟乙酸盐或乙酸盐)以进行优化。在LC-MS应用中,可以在流动相中加入少量水(3-5%),以提高方法的灵敏度和再现性。加入水有助于提高盐在甲醇中的溶解度。


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 手性GC

什么是环糊精?

环糊精的产生:部分降解淀粉,然后将葡萄糖单元酶促偶联成不同分子大小、具有均匀的环状结构的结晶。D(+)-葡萄糖残基通过α-(1,4)糖苷键彼此键合。葡萄糖残基的椅形配置使得环形“桶”在一端变窄。三种高度表征的环糊精是α、β和γ环糊精,它们分别含有六个、七个和八个葡萄糖单元。
 因为每个葡萄糖残基具有五个手性中心,所以环糊精本身是手性结构。例如,β-环糊精具有35个手性中心。

您的手性GC系列与竞争对手的产品有何区别?

品类齐全,范围广泛。我们提供常规的全甲基化相,但我们也有极性相(例如Supelco DEX 225和几种CHIRALDEX相)。我们总共提供24种不同的化学成分以及多种尺寸的色谱柱。

我的筛选方案中应该有哪些手性GC色谱柱?

根据我们使用在CHIRALDEX和Supelco DEX系列之间选择性差异的经验,我们建议将以下列色谱柱用于综合性GC筛选方案:

  1. Supelcoß-DEX 110(全甲基,2,3,6-三-O-甲基)
    ß-DEX 110是全甲基化相。它对于具有最低功能、饱和环状和饱和双环的饱和分析物尤其有效。
  2. Astec CHIRALDEX G-TA(三氟乙酰基,2,6-二-O-戊基-3-三氟乙酰基)
    G-TA分离出最多的对映异构体,通常具有高对映选择性。
  3. Astec CHIRALDEX B-DA(二烷基,2,6-二-O-戊基-3-甲氧基)
    B-DA最适合较大的多环结构。通常显示分离的反对映体(enantioreversal)在110(全甲基化)相中完成
  4. Astec CHIRALDEX B-DM(二甲基,2,3-二-O-甲基-6-叔丁基甲硅烷基)
    B-DM分离最广泛的不同结构类型。
  5. Astec CHIRALDEX G-PN(丙酰基,2,6-二-O-戊基-3-丙酰基)
    G-PN的作用类似于G-TA,但对某些胺(苯丙胺、甲基苯丙胺)、内酯和环氧化物显示出更高的选择性。6. Astec CHIRALDEX B-PH(羟丙基,(S)-2-羟丙基甲基醚)
    G-PH对于具有最低功能、饱和环状和饱和双环的饱和分析物尤其有效。与B-DA相相比,这种相通常显示出与洗脱顺序相反(反对映)。

手性GC中的衍生化:为什么是必要的,我选择什么类型的衍生物来分析哪种分析物?

当未衍生的化合物热稳定性差,或者挥发性不足以由气流携带时,GC中需要衍生物。一些化合物需要衍生化以获得良好的峰形。三氟乙酸酐用于醇和胺,而BSA和BSTFA也可用于那些官能团。对于酸,似乎可以使用甲醇HCl,也可以使用氯甲酸乙酯。仍然值得首先在柱上尝试未衍生化的样本,只是为了看它是否可行和进行比较。

如何在Supelco Dex和Astec甲基化相之间进行选择?

我们所有的手性GC色谱柱都有不同的选择性,没有直接重叠。我们的全甲基化(所有可用的羟基基团均被甲基化)相是Supelco α-DEX、β-DEX和ß-DEX 110和120、以及CHIRALDEX B-PM。我们还有二甲基化相(Supelco α-DEX、β-DEX和γ-DEX 325)和CHIRALDEX B-DM。如果价格是一个考虑因素,Supelco DEX比较便宜。

市面上有许多“全甲基化的”环糊精相用于手性GC。它们之间有什么区别?

全甲基化仅仅意味着CD分子上所有可用的-OH基团都被甲基化。除此之外,相可以在载体衍生化CD浓度(如果使用了载体)、载体类型(聚硅氧烷)、层厚度、毛细管直径、毛细管壁的灭活方法等方面有所不同。所有手性GC相的选择性各有不同,即使它们具有相同类型的相化学。

如何根据化合物官能团选择手性GC色谱柱?

Astec CHIRALDEX和Supelco DEX系列包含目前可用于手性GC分离的范围最广泛的衍生化环糊精(CD)相。26种不同的相包括三种不同的环糊精和九种不同的衍生物。根据分析物拟经历的相互作用的衍生物和类型,这些相被分为三大类。有关根据分析物官能团选择手性GC相的一般准则,请参阅我们的环糊精毛细管GC柱图(如下)。如果您在决定哪种GC CSP最适合您的分离时需要任何帮助,请咨询我们的技术服务团队。

环糊精毛细管GC色谱柱图(点击图片可放大)

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