HPLC故障排除指南


 如何识别、找出和纠正最常见的HPLC问题

尽管色谱柱技术和仪器的发展改进了HPLC方法,但仍然存在问题。在本指南中,我们为您提供了找出、识别和纠正诸多典型问题的系统方法。

无论您使用模块化系统还是使用更精密的设备,HPLC系统的重要组成部分都是相同的。每个组件都可能出现影响总体系统性能的问题。本指南讨论了一些常见问题。  本指南以易于使用的表格形式说明了这些问题的解决方案。


 找出HPLC问题

在HPLC系统中,引起问题的来源很多。首先界定问题,然后从源头上杜绝问题。

使用表1确定是哪个或哪些组件造成的问题。采用排除法通常可以帮助您查明具体原因并纠正问题。


 如何防止流动相问题

色谱图灵敏度低,基线上升、噪音、尖峰等通常因流动相所致。在梯度洗脱中,流动相中的污染物特别麻烦。它们可能会使基线上升,随着受污染的组分增加,可能出现伪峰。

水是反相分析中最常见的污染源。在配制流动相时,只能使用高纯度的蒸馏水或去离子水。然而,几种常见的脱离子剂会将有机污染物带入水中。要去除这些污染物,让去离子水通过活性炭或制备型C18柱。

仅使用HPLC级溶剂、盐、离子对试剂和酸碱改性剂。清洁质量较低的溶剂非常耗时,通常会残留痕量的污染物。使用高灵敏度UV或荧光检测器时,这些痕量污染物可能会导致问题。

因为许多水相缓冲液会促进细菌或藻类的生长,所以应新鲜制备这些溶液,并在使用前进行过滤(0.2 μm或0.45 μm过滤器)。过滤还去除可能产生基线噪音或堵塞色谱柱的颗粒。通过向水相缓冲液中加入约100 ppm的叠氮化钠来防止微生物生长。或者也可以将这些缓冲剂与20%或更高的有机溶剂(例如乙醇或乙腈)混合。

为防止系统中出现气泡,对流动相溶液脱气。通常首选在线脱气机,但如果流动相不含任何挥发性成分,则可以选择使用喷氦脱气。

小心使用离子对试剂。每次分析必须确定最佳链长和试剂浓度。浓度可低至0.2 mM,或高至150 mM或更高。通常,增加浓度或链长会增加保留时间。高浓度(> 50%)的乙腈或一些其他有机溶剂会沉淀离子对试剂。离子对试剂有些盐不溶于水并会沉淀。在存在长链磺酸(例如十二烷基硫酸钠)的情况下,应避免这种情况,用含钠缓冲液代替含钾缓冲液。

当您希望回收化合物用于进一步分析时,挥发性酸碱改性剂(例如三乙胺(TEA)和三氟乙酸(TFA))是有用的。这些改性剂还可以避免与离子对试剂相关的问题。它们还可以0.1至1.0%TEA或0.01至0.15%TFA的浓度添加至缓冲液中。增加浓度可以改善某些化合物的峰形,但会改变保留时间。

近年来,越来越广泛地回收用于等度分离的流动相,作为降低溶剂成本、处理成本和流动相制备时间的手段。Supelco SRS-3000或SRS-1000溶剂回收系统等仪器使用微处理器控制的开关阀,在检测到峰值时将溶剂流引导至废液箱。当基线低于所选阈值时,未污染的溶剂被引导回溶剂瓶。

 

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图A. HPLC系统的组成部分


 隔离泵问题

泵必须在各种条件下向色谱柱提供恒定的溶剂流量。现代HPLC泵采用单活塞或双活塞、注射器或隔膜泵设计。 泵系统问题通常易于发现和纠正。一些较常见的问题包括色谱图中保留时间不稳定,基线噪音或尖峰。泵配件或密封件泄漏会导致色谱分析不良。泄漏的确切迹象是在泵连接处有盐析出。应每天用新鲜的去离子水从系统中冲洗缓冲盐。要找出和修复与设备相关的特定问题,请参阅操作手册中的故障排除和维护部分。需要定期更换泵密封件。应定期进行维护,而不是等待问题发生。

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 进样器和进样溶剂

进样器可快速地将样品导入系统,对溶剂流的干扰最小。HPLC系统目前采用可变环、固定环和针式进样器。进样器有手动、气动或电动驱动选择。

进样器的机械问题(例如,漏液、毛细管管线堵塞、密封件磨损)易于发现和纠正。使用柱前过滤器可防止因进样器密封件的物理老化而导致的色谱柱筛板堵塞。不可再现进样等其他问题,则较难解决。

定量环未完全填充、进样溶剂与流动相不相容或样品溶解度差,均可能导致峰高易变、裂峰和宽峰。尽可能在流动相中溶解和注入样品。否则,应确保进样溶剂的洗脱强度低于流动相(表3)。请注意,某些自动进样器使用单独的针筒清洗液。确保清洗液与流动相兼容且比流动相弱。在反相和正相分析之间切换时,这一点尤为重要。

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 色谱柱保护

虽然流动相入口过滤器、进样前过滤器、柱前过滤器、以及保护柱不属于大多数设备的必备部件,但它们大大减少了与复杂分离相关的问题。我们建议让所有样品经过0.45 μm或0.2 μm针筒过滤器过滤。我们强烈建议使用保护柱。

过滤器和保护柱可防止颗粒和强保留化合物积聚在分析柱上。这些一次性产品的使用寿命取决于流动相成分、样品纯度、pH值等。当这些装置被颗粒污染或堵塞时,压力增加,峰值变宽或分裂。例如,图B给出了使用保护柱的示例。有关色谱柱保护的详细信息,请参阅本指南的产品部分,亦可索取公告781。

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图B. Supelguard柱延长分析柱的寿命

 

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 充分利用分析柱

无论色谱柱是否包含键合的反相或正相、离子交换、亲和性、疏水性相互作用、分子筛或树脂/硅基填料,与分析柱相关的最常见问题是劣化。劣化的迹象包括峰形差、裂峰、肩峰、解析度降低、保留时间减少和背压高。这些迹象表明污染物积聚在筛板或色谱柱入口处,或者填料层中存在空洞、沟槽或凹陷。

在高效柱中,劣化更明显。例如,与由2微米或更大筛板截留的5微米或10微米填料相比,由0.5微米筛板截留的3微米填料更容易堵塞。适当的色谱柱保护和样品制备对于发挥色谱柱的最大功效至关重要。

过载色谱柱会导致峰形差和其他问题。色谱柱容量取决于多种因素,但色谱柱上分析物总量的典型值如下:

分析柱(25cm×4.6mm):<500μg
半制备柱(25cm×10mm):<100mg
制备柱(25cm×21.mm):<500mg

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 解决检测器问题

检测器问题分为两类——电气和机械/光学问题。
 如有电气问题,请联系仪器制造商。机械或光学问题通常因流动池所致。与检测器相关的问题包括漏液、气泡和流通池污染。这些通常会引起色谱图出现尖峰或基线噪音或低灵敏度。

某些流通池,尤其是用于折射率检测器的流通池,对压力敏感。  超过制造商建议的流速或背压将破坏流通池窗。旧灯或坏灯以及不正确的检测器上升时间、增益或衰减将降低灵敏度和峰高。电缆连接错误或反接也可能是导致问题的根源。

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 色谱柱恒温箱、记录器

这些组件很少会导致系统出现问题。我们将在故障排除表(表1)中详细讨论这点。

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 保留准确的记录

大多数问题不会一夜之间发生,而是有个发展的过程。准确地保存记录对于发现和解决许多问题来说至关重要。

评估您所收到的每个色谱柱,并在日后进行定期评估。通过保存色谱柱柱效、所使用的流动相、灯电流、泵性能等的书面记录,您可以监控系统的性能。

记录还有助于防止错误,例如将水导入硅胶柱,或因添加过多的有机溶剂而使系统中的缓冲液发生沉淀。许多分析员会对HPLC系统做一些修改。可靠的记录是确保修改不会导致问题的最佳方法。与泵、检测器、自动进样器和数据系统相关的问题,请参阅仪器手册的故障排除指南。

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 问题索引

 

问题 问题编号
基线
   漂移 12
   噪音(不规则的) 14
   噪音(规则的) 13
   
色谱柱背压
   高于正常值 4
   低于正常值 3
   
鬼峰 19
   
异常峰形
   宽峰 15
前伸峰 10
   圆弧形峰 11
   裂峰 7
   拖尾 89
   
   高度变化 16
   峰丢失 2
   负峰 18
   无峰 1
   不可分辨峰 6
   
保留时间不断变化 5
   
选择性改变 17

 

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表1. HPLC问题,可能原因和纠正措施

问题1:无峰/峰非常小

问题

可能的原因

  1. 检测器灯关闭


  2. 检测器和积分仪或记录器之间的导线松动 / 断裂。


  3. 无流动相流。


  4. 无样品 / 样品劣化 / 样品有误。


  5. 检测器或记录器设置过高。


纠正措施 / 建议

  1. 开灯。


  2. 检查电气连接和电缆。


  3. 参见“无液流”(问题2)。


  4. 确保自动进样器样品瓶中有充足的液体且样品中没有气泡。采用新标样评估系统性能,以确认样品是否为问题的根源。


  5. 检查衰减或增益设置。检查灯泡状况。必要时自动归零。


问题2:无液流

问题

可能的原因

  1. 泵关闭


  2. 流动中断 / 阻塞。


  3. 漏液。


  4. 泵头有空气。(压力波动说明这点。)


纠正措施 / 建议

  1. 启动泵。


  2. 检查储液罐中的流动相液位。检查整个系统的液流。检查定量环是否有阻塞或气塞。确保流动相组分可混溶,流动相适当脱气。


  3. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。


  4. 断开保护柱(如果有)或分析柱入口处的管线。检查液流。以高流速(例如5-10 mL/min)冲洗泵,如有必要,预湿润系统。(分别预湿润每个泵头。)如果系统有单向阀,则松开阀门,让空气逸出。如果问题仍然存在,则用100%甲醇或异丙醇冲洗系统。如果还未能解决问题,则应联络系统制造商。


问题3:无压力 / 压力过低

问题

可能的原因

  1. 漏液。

  2. 流动相液流中断/阻塞。

  3. 泵头有空气。(压力波动说明这点。)

  4. 色谱柱入口端接头泄漏。

  5. 系统其他地方有空气。

  6. 泵密封件磨损导致泵头周围泄漏。

  7. 单向阀故障。

  8. 泵密封不良。

纠正措施 / 建议

  1. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。

  2. 检查储液罐中的流动相液位。检查整个系统的液流。检查定量环是否有阻塞或气塞。确保流动相组分可混溶,流动相适当脱气。

  3. 断开保护柱(如果有)或分析柱入口处的管线。检查液流。以高流速(例如10 mL/min)冲洗泵,如有必要,预湿润系统。(分别预湿润每个泵头。)如果系统有单向阀,则松开阀门,让空气逸出。

  4. 以两倍的流速重新接通色谱柱和泵溶剂。如果压力仍然很低,则应检查入口接头或柱端接头是否有泄漏。

  5. 断开保护柱和分析柱,并冲洗系统。重新连接色谱柱。如果问题仍然存在,则用100%甲醇或异丙醇冲洗系统。

  6. 更换密封件。如果问题仍然存在,则更换活塞和密封件。

  7. 重新装配或更换阀门。

  8. 更换密封件。

问题4:压力过高

问题

可能的原因

  1. 泵、进样器、在线过滤器或管线存在问题。

  2. 保护柱或分析柱堵塞。

纠正措施 / 建议

  1. 从系统中取出保护柱和分析柱。改用活接头和0.010''内径(I.D.)或更粗的管线将进样器重新连接到检测器。以2-5 mL/min的速度运行泵。如果压力极小,则请参见原因2。如果不是,则系统地排除系统组件找出原因,从检测器开始,然后检查在线过滤器,再检查泵。更换泵过滤器(如果有)。

  2. 取下保护柱(如果有)并检查压力。必要时更换保护柱。如果分析柱阻塞,则在与检测器断开连接情况下反过来冲洗色谱柱。  如果问题仍然存在,则色谱柱可能被强保留污染物堵塞。建议使用适当的再生程序(表2)。如果问题仍然存在,则更换入口处的筛板或更换色谱柱。

问题5:保留时间变化

问题

可能的原因

  1. 漏液。

  2. 流动相成分发生变化。(小变化亦可能导致保留时间发生较大的变化。)

  3. 泵中有空气。(保留时间随机增加和减少。)

  4. 柱温波动(在离子交换系统中尤为明显)。

  5. 色谱柱过载。(注射在柱上的溶质质量超过柱容量时,保留时间通常会减少。)

  6. 样品溶剂与流动相不相容。

  7. 色谱柱问题。(并非保留时间不稳定的常见原因。随着色谱柱老化,保留时间逐渐减少。)

纠正措施 / 建议

  1. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。

  2. 检查流动相的组成。如果流动相是按照比例值机器混合的,则手动混合并从一个储液罐供应。

  3. 排出泵头或单向阀的空气。必要时更换泵密封件。确保流动相脱气。

  4. 使用可靠的柱温箱。  (注意:较高的色谱柱温度可提高色谱柱效率。为获得最佳结果,洗脱液应先加热再导入色谱柱。)

  5. 注入较小的体积(例如10 μL,而不是 100 μL)或在1:10或1:100稀释样品后注入相同的体积。

  6. 调节溶剂。尽可能在流动相中注入样品。

  7. 替换为相同类型的新柱,以确认是否因色谱柱的原因。如果再生程序失败,则丢弃旧的色谱柱。

问题6:解析度降低

问题

可能的原因

  1. 流动相污染或变质(引起保留时间和/或选择性变化)。

  2. 保护柱或分析柱阻塞。

纠正措施 / 建议

  1. 制备新鲜的流动相

  2. 取下保护柱(如果有)进行分析。必要时更换保护柱。如果分析柱阻塞,可反过来冲洗。如果问题仍然存在,则色谱柱可能被强保留污染物堵塞。建议使用适当的再生程序(表2)。如果问题仍然存在,则更换入口处的筛板或更换色谱柱。

问题7:裂峰

问题

可能的原因

  1. 保护柱或分析柱入口污染。

  2. 筛板部分堵塞。

  3. 色谱柱入口处有小(不规则)空洞。

  4. 样品溶剂与流动相不相容。

纠正措施 / 建议

  1. 取下保护柱(如果有)进行分析。必要时更换保护柱。如果分析柱阻塞,可反过来冲洗。如果问题仍然存在,则色谱柱可能被强保留污染物堵塞。建议使用适当的再生程序(表2)。如果问题仍然存在,则入口处的筛板可能(部分)堵塞。更换筛板或更换色谱柱。

  2. 更换筛板(见上文)。

  3. 用具有相同键合相功能的薄壳型颗粒重新填充色谱柱顶部。继续沿反向流动方向使用色谱柱。

  4. 调节溶剂。尽可能在流动相中注入样品。

问题8:初次和后期进样时出现峰拖尾

问题

可能的原因

  1. 样品与活性位点发生反应。

  2. 流动相pH值错误。

  3. 色谱柱类型错误。

  4. 色谱柱入口处有小(不规则)空洞。

  5. 进样溶剂错误。

纠正措施 / 建议

  1. 首先用色谱柱测试混标检查色谱柱性能。如果测试混标的检查结果良好,则添加离子对试剂或类似的碱或酸改性剂

  2. 调节pH值,对于碱性化合物,低pH值更有利于得到对称峰。

  3. 试用其他色谱柱类型(例如碱性化合物去活色谱柱)。

  4. 详见问题7

  5. 当样品注入比流动相更强的溶剂时,会出现峰拖尾。将样品溶解于流动相中。

问题9:拖尾峰

问题

可能的原因

  1. 保护柱或分析柱污染 / 失效。

  2. 流动相污染 / 变质。

  3. 样品中有干扰组分。

纠正措施 / 建议

  1. 取下保护柱(如果有)进行分析。必要时更换保护柱。如果问题源于分析柱,则运用适当的再生程序(表2)。如果问题仍然存在,则更换色谱柱。

  2. 检查流动相的组分。

  3. 用标样检查色谱柱性能。

问题10:前伸峰

问题

可能的原因

  1. 色谱柱过载。

  2. 样品溶剂与流动相不相容。

  3. 在主峰之前出现肩峰或基线逐渐上升可能是因为存在其他样品成分造成。

纠正措施 / 建议

  1. 注入较小的体积(例如10 μL,而不是 100 μL)。在质量过载的情况下,以1:10或1:100的比例稀释样品。

  2. 调节溶剂。尽可能在流动相中注入样品。  用50倍柱体积的HPLC级乙酸乙酯以2-3倍标准流速冲洗极性键合相柱,然后在分析前用中等极性溶剂冲洗。

  3. 提高效率或改变系统选择性以提高解析度。如有必要,尝试其他色谱柱类型(例如从非极性C18更换为极性氰基相)。

问题11:圆弧形峰

问题

可能的原因

  1. 检测器在线性动态范围外工作。

  2. 记录器增益设置太低。

  3. 色谱柱过载。

  4. 样品与色谱柱发生反应。

  5. 检测器和 / 或记录器时间常数设置太高。

纠正措施 / 建议

  1. 降低样品量和 / 或降低浓度。

  2. 调节增益。

  3. 注入较小的体积(例如10 μL,而不是 100μL)或以1:10或1:100的比例稀释样品。

  4. 改变缓冲液强度、pH值或流动相组分。如有必要,提高色谱柱温度或改变色谱柱类型。  (溶质结构分析可能有助于预测相互反应。)

  5. 将设置降至最低值或不再产生进一步改善的值。

问题12:基线漂移

问题

可能的原因

  1. 柱温波动。(即使很小的温度变化都会引起基线波动。通常会影响折光率和电导率检测器、高灵敏度的UV检测器或间接光度模式。)

  2. 流动相不均匀。(通常漂移到更高的吸光度,而不是温度波动的循环模式。)

  3. 检测器流通池中有污染物或气体积聚。

  4. 检测器出口管路阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生基线噪音。)

  5. 流动相混合问题或流速变化。

  6. 柱平衡慢,特别是流动相发生变化时。

  7. 流动相污染、变质或未由优质化学品制备。

  8. 样品中的强保留物质(高K’值)可以极宽峰洗脱,表现出逐步升高的基线。(梯度分析会使问题加剧。)

  9. 检测器(UV)未设置在最大吸光度处,而是设置在曲线斜坡处。

纠正措施 / 建议

  1. 控制色谱柱和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器。

  2. 使用HPLC级的溶剂、高纯度盐和添加剂。在使用前进行流动相脱气,在使用过程中喷氦气。

  3. 用甲醇或其他强溶剂冲洗流通池。如果必要,可以用1N HNO3清洁流通池(切勿使用HCl,切勿对PEEK管或配件使用硝酸)。

  4. 拔下或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。

  5. 更正组分 / 流速。为避免这个问题,可定期检查流动相组分及流速。

  6. 用中等强度的溶剂冲洗色谱柱,在分析前用10-20倍柱体积的新流动相对冲洗色谱柱。

  7. 检查流动相的组分。

  8. 使用保护柱。如有必要,在两次进样之间,或在分析过程中定期,用强溶剂冲洗色谱柱。

  9. 将波长调整至最大UV吸光度处。

问题13:基线噪音(规则的)

问题

可能的原因

  1. 在流动相、检测器流通池或泵中有空气。

  2. 泵脉动。

  3. 流动相混合不完全。

  4. 温度影响(柱温过高,检测器未加热)。

  5. 在同一条管路上有其他电子设备。

  6. 漏液。

纠正措施 / 建议

  1. 流动相脱气。冲刷系统以除去检测器流通池或泵中的空气。

  2. 在系统中加入脉冲阻尼器。

  3. 手动混合流动相或使用低粘度的溶剂。

  4. 降低电压(differential)或加上热交换器。

  5. 断开LC、检测器和记录器,检查问题是否来自于外部。在必要时加以更正。

  6. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。

问题14:基线噪音(不规则的)

问题

可能的原因

  1. 漏液。

  2. 流动相污染、变质或由低质材料配成。

  3. 检测器 / 记录器电子元件的问题。

  4. 系统内有气泡。

  5. 检测器内有气泡。

  6. 流通池污染。(即使是极少的污染物也会产生噪音。)

  7. 检测器灯能量不足。

  8. 色谱柱硅或填料流失。

纠正措施 / 建议

  1. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。

  2. 检查流动相的组分。

  3. 断开检测器和记录器的电源。请参阅使用指南来解决问题。

  4. 用强溶液清刷系统。

  5. 清洗检测器。在检测器后面安装背压调节器。参考仪器手册,尤其是RI检测器部分(过高的背压会导致流通池破裂)。

  6. 清洗流通池。

  7. 更换灯。

  8. 更换色谱柱并清洁系统。

问题15:宽峰

问题

可能的原因

  1. 流动相组分发生变化。

  2. 流动相流速太低。

  3. 漏液(特别是在色谱柱与检测器之间)。

  4. 检测器设置不正确。

  5. 柱外效应:
    1. 色谱柱过载
    2. 检测器反应时间或流通池体积过大。
    3. 色谱柱与检测器之间的管线太长或管线内径太大。
    4. 记录器响应时间太长。

  6. 缓冲液浓度太低。

  7. 保护柱污染/失效。

  8. 色谱柱污染/失效。

  9. 色谱柱入口空洞。

  10. 所出现的峰代表两种或多种解析不良的化合物。

  11. 柱温过低。

纠正措施 / 建议

  1. 重新制备新的流动相。

  2. 调节流速。

  3. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液,是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。

  4. 调节设置值。


    1. 注入较小的体积(例如10 μL,而不是 100μL)或以1:10或1:100的比例稀释样品。

    2. 减少响应时间或使用更小的流通池。

    3. ;在可行的情况下,使用内径为0.007~0.010“的短管。

    4. 减少响应时间。

  5. 增加浓度。

  6. 更换保护柱。

  7. 换成同类型的新色谱柱。如果新柱未提供窄峰,则冲刷旧柱(表2),然后重新测试。

  8. 更换色谱柱,或打开入口端填补空洞.

  9. 更换色谱柱类型,以改善分离效果。

  10. 提高柱温。除非色谱柱制造商说明可采用更高的温度,否则温度不宜超过75℃。

问题16:峰高变化(一个或多个峰)

问题

可能的原因

  1. 一个或多个样品组分变质或色谱柱活性发生变化。

  2. 漏液,特别是在进样口与色谱柱入口之间。(保留时间也会改变。)

  3. 样品量不一致。

  4. 检测器或记录器设置被更改。

  5. 检测器灯能量不足。

  6. 检测器流通池污染。

纠正措施 / 建议

  1. 采用新鲜样品或标样,以确认样品是否为问题的根源。如果某些或所有峰值仍小于预期值,则更换色谱柱。如果新的色谱柱改善了分析,则尝试运用适当的程序(表2),再生旧的色谱柱。如果性能未得到提高,则丢弃旧的色谱柱。

  2. 检查系统是否有松动的配件。检查泵是否有漏液、是否有盐析出和异常噪音。必要时更换泵密封件。

  3. 确保样品一致。 对于固定体积定量环,使用2-3倍环体积以确保环被完全充满。确保自动进样器样品瓶中有充足的样品且没有气泡。检查进样针是否有空气。在具有洗涤或冲刷步骤的系统中,确保洗涤溶液不会沉淀样品组分。

  4. 检查设置。

  5. 更换灯。

  6. 清洗流通池。

问题17:选择性发生变化

问题

可能的原因

  1. 增加或减少溶剂离子强度、pH或添加剂浓度(特别影响离子溶质)。

  2. 色谱柱被更换,新色谱柱的选择性与旧色谱柱不同。

  3. 样品被注入错误的溶剂,或者过量注入强溶剂(100-200 μL)。

  4. 柱温发生变化。

纠正措施 / 建议

  1. 检查流动相的组分。

  2. 确认色谱柱填料类型。对于可再现分析,使用相同的色谱柱类型。确定变化是否逐渐发生。如果是,则键合相可能已被剥离。色谱柱活性可能发生改变,或色谱柱可能已被污染。

  3. 调节溶剂。尽可能在流动相中注入样品。

  4. 调节温度。如果必要,使用柱温箱保持恒温。

问题18:负峰

问题

可能的原因

  1. 进样器或色谱柱污染。

  2. 样品中存在后期洗脱峰(通常为宽峰)。

纠正措施 / 建议

  1. 在两次分析之间冲刷进样器(良好的常规操作)。如有必要,在柱中加入强溶剂以除去后期洗脱液。在梯度分析最后,加入清洗步骤,以去除强保留的化合物。
    1. 检查样品制备。
    2. 采用(分段)梯度以快速洗脱组分。


 进一步的建议

我们建议您参考仪器手册的维护和故障排除部分。现代HPLC系统通常具有自诊断功能,有助于确定仪器的故障区域。对于色谱柱或特定分析中无法消除的问题,请联系Supelco技术服务门。

本指南的其余部分概述了在解析度、保留或选择性丧失后再生色谱柱的步骤,有关如何防止和解决色谱柱硬件问题的建议,以及Supelco产品目录中的色谱柱保护产品。请参阅我们的产品目录,了解我们的全套配件,这些配件可延长色谱柱的使用寿命,通常可简化或改进您的HPLC或FPLC®分析。

最后,您可致电我们索取有关HPLC和FPLC产品的更多资料,或使用我们的ChromFax服务直接查阅我们的所有免费技术资料。


 恢复色谱柱的性能

应遵循以下流程恢复因样品污染而导致性能下降的色谱柱的性能。

将色谱柱断开并反转。将色谱柱与泵连接,但不接检测器。遵循此中的相应冲刷程序,所使用的流速应能产生1500-4500 psi的色谱柱背压,但不得高于制造商使用指南中建议的最大压力。如果您使用SUPELCOSIL色谱柱,则用测试混标和数据表中规定的条件进行分析。柱效、对称性和容量不得超过测试数据表规定的值的10-15%。如果不在该范围内,则重新填充色谱柱入口或更换色谱柱。

说明:表2中列出的体积适用于25 cm x 4.6 mm内径、柱体积为4.15 mL的色谱柱。再生长度小于或大于25 cm的4.6 mm内径色谱柱时,应将 表2中的所有体积乘以色谱柱长度与25的比值(例如,对于15cm色谱柱:将表2中体积乘以15/25或0.6)。再生内径不是4.6mm的色谱柱时,应将表2中的所有体积乘以色谱柱内径平方与(4.6)2的比值(例如,对于3.2mm内径的色谱柱:(3.2)2/(4.6)2 = 10.24/21.16 = 0.48 乘以表2中的值)。

表2:色谱柱再生流程

硅胶柱
用以下溶剂进行冲刷:

  1. 50mL己烷
  2. 50mL二氯甲烷
  3. 50mL 2-丙醇
  4. 50mL甲醇
  5. 25mL二氯甲烷
  6. 25 mL流动相

根据制造商规定的条件评估色谱柱性能。

说明:关于再生失活硅胶柱的方法,另请参阅硅胶柱再生溶液


硅基反相色谱柱(烷基(C8、C18等)、苯基或二苯基色谱柱,SUPELCOSIL LC-PAH色谱柱)

A. 水溶性样品用以下溶剂冲刷:

  1. 用温(60°C)蒸馏水冲刷
  2. 50mL甲醇
  3. 50mL乙腈
  4. 25mL甲醇
  5. 25 mL流动相

评估色谱柱性能。

B. 不溶于水的样品用以下溶剂冲刷:

  1. 50mL 2-丙醇
  2. 50mL二氯甲烷
  3. 50mL己烷
  4. 25 mL异丙醇
  5. 25 mL流动相

评估色谱柱性能。


极性键合相色谱柱(氨基、氰基或二醇基色谱柱或Pirkle手性柱)

在反相模式(例如,有机溶剂/水相缓冲液流动相)中使用的色谱柱的清洗程序与硅基反相色谱柱的清洗程序相同。对于使用非水性流动相的色谱柱,清洗程序如下:

用以下溶剂冲刷:

  1. 50mL氯仿
  2. 50mL甲醇
  3. 50mL乙腈
  4. 25mL二氯甲烷
  5. 25mL甲醇
  6. 25 mL流动相

评估色谱柱性能。

SUPELCOSIL LC-PCN色谱柱

A. 去除蛋白质
用10倍柱体积的50:50乙腈/水(内含0.1% 三氟乙酸)冲刷。

B. 去除TCA
用10倍柱体积的蒸馏水冲刷(用H3PO4将pH调至2.5),然后用10倍柱体积的以下溶液冲刷:

  1. 水(去除盐)
  2. 甲醇(去除水)
  3. 50:50甲醇/二氯甲烷(普通清洁液)
  4. 甲醇

如果色谱柱性能仍未达到要求,则制备10X分析浓度的流动相缓冲液,通过色谱柱循环整夜。* 
用常规缓冲液浓度的流动相重新平衡色谱柱并重新评估。

* 请注意:对于某些缓冲液类型和/或浓度,浓度增加10倍会导致沉淀。


硅基离子交换色谱柱
(强或弱的阴离子或阳离子交换)


涉及离子交换系统的大多数分析使用离子流动相。可能影响色谱柱性能的化合物通常不溶于水或仅微溶于水。以下程序能够较好地去除这些化合物。

用以下溶剂冲刷:

  1. 50mL热(40-60°C)蒸馏水
  2. 50mL甲醇
  3. 50mL乙腈
  4. 25mL二氯甲烷
  5. 25mL甲醇
  6. 25 mL流动相

评估色谱柱性能。


用于蛋白质和多肽反相液相色谱(RPLC)的硅基色谱柱

按照硅基反相色谱柱的实验方案进行。

或者,一次或多次注入100μL三氟乙醇(在每次进样后评估色谱柱性能,从而确定进样次数)。

评估色谱柱性能。


表3. HPLC中常用的有机溶剂的性质

 

溶剂 极性 是否与水混溶? UV吸光下限 折光率(20 °C) 溶剂强度,
o(硅胶)
粘度/cP(20 °C)
己烷 非极性



极性
200 1.3750 0.00 0.33
异辛烷 200 1.3910 0.01 0.50
四氯化碳 263 1.4595 0.14 0.97
氯仿 245 1.4460 0.31 0.57
二氯甲烷 235 1.4240 0.32 0.44
四氢呋喃 215 1.4070 0.35 0.55
二乙醚 215 1.3530 0.29 0.23
丙酮 330 1.3590 0.43 0.32
乙酸乙酯 260 1.3720 0.45 0.45
二氧六环 215 1.4220 0.49 1.54
乙腈 190 1.3440 0.50 0.37
2-丙醇 210 1.3770 0.63 2.30
甲醇 205 1.3290 0.73 0.60
–– 1.3328 >0.73 1.00

• 典型值

暴露于极性溶剂的非键合二氧化硅色谱柱

含有极强极性溶剂(如水或醇)的样品和流动相会使未涂覆硅基HPLC色谱柱失活。这会极大地影响色谱柱性能,特别是溶质保留和选择性。(图C2)。即使使用非极性溶剂长时间冲刷色谱柱,也只能部分地再生色谱柱性能,并且浪费化学品。二氧化硅再生溶液通过去除所吸附的极性物质,经济而快速地再生二氧化硅色谱柱的性能。将溶液以4mL/分钟的速率泵入受影响的色谱柱10分钟,然后用流动相以2mL/分钟的速率冲刷10分钟。使用用于评估二氧化硅色谱柱的测试混标(货号:58281)评估色谱柱性能。性能应与导入极性溶剂之前的性能基本相同(图C3)。

二氧化硅色谱柱再生溶液,200 mL(货号:33175

图C. 用再生溶液再生二氧化硅色谱柱性能

色谱柱测试混标

HPLC色谱柱的性能评估混标。

良好的测试混标能够助您排除色谱问题,优化系统效率,并在了解其性能的条件下评估色谱柱。我们供货是将测试混标装在琥珀色安瓿中,以防止光降解,并提供正确使用指南和结果说明。

可选用色谱柱或应用专用混标。关于我们的各类测试混标,请查看我们的产品目录,或致电我们的技术服务部门。

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 预防和解决常见的硬件问题

预防漏液

高浓度盐(> 0.2 M)和腐蚀性流动相会降低泵密封的有效性。进样器转子密封件的寿命还取决于流动相条件,特别是在较高的pH值下操作时。在某些情况下,长时间使用离子对试剂对泵活塞虽具有润滑作用,但这可能会导致密封件轻微漏液。某些密封件在特定溶剂中表现不佳。在不利条件下使用泵之前,请参阅仪器制造商的规格。如要更换密封件,请参阅泵使用手册的维护部分。

清理色谱柱筛板的堵塞物

如要清洁入口,请将色谱柱断开并反转。将其与泵连接(但不连检测器),并以标准流速的两倍泵送溶剂。约5-10倍柱体积的溶剂足以去除入口处筛板上的少量颗粒物。使用标准测试混标评估已清洁的色谱柱的性能。

有时溶剂冲洗(见上文)和再生程序(见表2)都不能恢复色谱柱的性能。如果您已确定问题源于色谱柱,且其他再生程序都已失败,则可能填料有空洞或入口处筛板一直堵塞。

作为最后的手段,打开色谱柱的入口端。注意:打开入口端,以及打开出口端,可能会永久性地损坏填料层。在打开色谱柱之前,请参阅制造商的资料。(切勿打开树脂填料色谱柱的任何一端)。

按照以下程序打开色谱柱。

  1. 从系统上取下色谱柱。为防止填料从色谱柱中渗出,请尽快执行后续步骤。
  2. 使用虎钳和扳手或两把扳手小心地拆下入口端接头(参见图D)。如果筛板留在接头中,则在硬表面上敲击接头把筛板敲出来。如果筛板留在色谱柱上,则将其滑下来,而不是向上提下来。这有助于保持填料层的完整性。
    模块化色谱柱可能需要特殊工具(例如,货号:55216)来移除筛板盖。
  3. 检查旧筛板。将筛板压在不锈钢管上会在正确安装的筛板的色谱柱一侧的边缘上留下一个环。如果没有环,可能意味着套圈太靠近管的末端。由此导致的松动连接可能会泄漏二氧化硅,或者起到一个混合室的作用。
  4. 检查填料层。如果填料层塌陷或断裂,则需要更换新的色谱柱。
  5. 更换筛板。
  6. 更换端部接头。用手拧紧,然后用扳手拧紧1/4圈。

图D. 典型的HPLC色谱柱设计


 柱保护产品的选择

Supelco™流动相过滤装置
(连接到吸取管线)

 

通过去除溶剂和其他流动相组分中的颗粒和气体来保护仪器和色谱柱。尼龙66滤膜过滤器与HPLC中常用的所有溶剂相容。

过滤装置1
(连接至1000 mL的侧臂烧瓶)
包括250 mL玻璃储液罐、漏斗底座和塞子、夹具、不锈钢换膜过滤器和滤网、10个特氟龙垫片、50个尼龙66过滤器(47 mm, 0.45 μm孔)

过滤装置2
(连接到吸取管线)
包括250 mL玻璃储液罐,34/45锥形漏斗底座,34/45 1000 mL锥形烧瓶和玻璃盖、夹具、不锈钢换膜过滤器和滤网,10个Teflon垫片,50个尼龙66过滤器(47 mm,0.45 μm孔)。

描述 货号
Supelco流动相过滤装置
过滤装置 1 58061
过滤装置 2 58062-U
备用玻璃零件
适用于过滤装置1  
   储液罐,250 mL 58063
   储液罐,500 mL 58074
   漏斗底座和塞子 58064
适用于过滤装置2  
   锥形漏斗底座 58068
   锥形烧瓶,1000 mL,用于装置2 58070-U
   锥形烧瓶,2000 mL,用于装置2 58075
   烧瓶盖,用于装置2 58071
两个装置的备用过滤器部件
换膜过滤器和滤网,SS 58065
垫片,特氟龙(10片/包) 58066
过滤器,尼龙66,47 mm(50片/包)  
   0.45 μm孔 58067
   0.20 μm孔 58060-U
弹簧夹 58053

Supelco流动相脱气系统

  • 4路
  • 0-5 mL/min 流量范围
  • 验证输出满足系统合规性要求
  • 智能传感器检测泄漏并与真空泵通信
  • LED指示脱气状态
  • 从未有过的4年质保

Supelco流动相脱气系统及其智能传感器不仅可以检测漏液和发出漏液警报,还可以与真空泵进行通信。如果检测到由于流动相流速变化而引起的真空度变化,则泵可以通过改变其速度进行补偿。验证报告记录了真空度,以满足系统合规性和验证要求。脱气系统配备Teflon®AF膜以及NO-OX™接头和管线。

描述 货号
Supelco流动相脱气系统
55018-U


过滤器

柱前过滤器对于保护HPLC色谱柱不受颗粒物质的影响至关重要,这些颗粒物质会积聚在色谱柱筛板上,导致裂峰和高背压。颗粒来源包括流动相(特别是当缓冲液与有机溶剂混合时)、泵和进样器密封以及样品。使用2.0μm筛板来保护含有5μm或更大颗粒的色谱柱,或使用0.5μm筛板来保护粒径小于5μm的色谱柱。

Supelco Filter

直接连接;保护分析柱和保护柱。

我们的柱前过滤器可以直接手动连接到我们当前产品目录中列出的所有HPLC色谱柱或保护柱,或与任何其他具有Valco兼容端接头的色谱柱连接。PEEK盖和柱体,2μm不锈钢筛板。对于无金属系统,订购PEEK/特氟隆备用筛板(货号:57430-U)。

 

描述 货号
Supelco柱前过滤器 Z227323
筛板(5片/包)  
   0.5 μm孔 Z29087-4
   2 μm孔 Z22733-1
   PEEK/特氟隆,2 μm1 57430-U

1生物相容,无金属。


SSI高压柱前过滤器

在线安装。 316不锈钢过滤盘(0.5μm孔径)易于更换,无需拆下柱端接头。最大工作压力:15,000 psi(1054 kg/cm²)。适用于1/16“管。

描述 货号
SSI High Pressure Precolumn Filter  
10-32 Threads2 59269
Waters Threads
59271
Filter Elements and Seals (pk. of 10)
 
0.5 μm pores
59273
2 μm pores 59272

2除SSI和某些Waters接头外,大多数HPLC接头都有10-32螺纹。


SSI高压进样器前过滤器

SSI高压进样器前过滤器 安装在泵和进样器之间,对流动相进行最终过滤。可轻松更换的316不锈钢过滤元件(0.5μm孔)。最大工作压力:15,000 psi(105 MPa)。对于1/16“外径管,10-32螺纹2

描述 货号
SSI高压进样器前过滤器 59262-U
备用过滤元件和密封件(2片/包)  
  0.5 μm孔 59264
  2 μm孔 59265

2除SSI和某些Waters接头外,大多数HPLC接头都有10-32螺纹。

Valco柱前筛板和筛滤器3

在线安装。高效、低死体积的过滤器保护色谱柱免受颗粒影响,同时不会降低色谱柱性能。可更换的1/8"筛板孔径为0.5μm,用于保护3μm或5μm的色谱柱填料,可更换的滤网孔径为2μm。选用筛板过滤器有助于获得更高的过滤能力(适合大多数应用),选用筛滤器则有助于减少死体积(例如使用微径柱)。使用1/16“外径管,含1/16“接头。

 

描述 货号
Valco柱前过滤器  
   筛板过滤器 58420-U
   筛滤器 58279-U
筛板(10片/包)  
   0.5 μm孔 59037
   2 μm孔 59129
滤网(10片/包) 58284


3在这些过滤器中筛板和滤网不可互换。


分离技术的柱前过滤器

在线安装。大容量入口过滤器最大限度地减小死体积和谱带变宽,从而在保护色谱柱的同时防止柱效降低。筛板孔隙率:0.5μm。如图所示完成。

描述 货号
分离技术的柱前过滤器  
   配备3mm筛板(4.6mm色谱柱) 57675-U
   配备1.5mm筛板(2.1mm色谱柱) 57676-U
筛板(5片/包)  
   3 mm 57677
   1.5 mm 57678

Upchurch柱前过滤器

在线安装。不锈钢壳体,配备惰性聚醚醚酮(PEEK)端接头,一端接头配有0.5μm或2μm PEEK筛板。

 

描述 货号
Upchurch柱前过滤器  
   0.5 μm 筛板 55079
   2 μm 筛板 55078
筛板(10片/包)  
   0.5 μm 55080-U
   2 μm 55081

Rheodyne 7725型和7725i型进样器

Rheodyne 7725型进样器可以精密准确地注入1μL-5 mL样品。该进样器坚固耐用,易于维护,具备诸多高级功能:

  • 获得专利的连续流设计(见图) - 在从上样(LOAD)至进样(INJECT)切换时保持流动的连续性。
  • 用进样器前端压力调节螺丝可轻松调节密封。
  • 较宽的端口角度(30度),易于与接头连接。

进样器配备20μL定量环,并配有可由Tefzel转子密封替换的VESPEL转子密封,能够在pH 0-14下操作。出厂设置为5000 psi(345 bar),可调节至7000 psi(483 bar)。7725i型内置位置传感开关。
 

7725型进样器减少色谱柱的磨损

 

传统的HPLC阀门会在进样时暂时中断流动,使色谱柱受到双重压力冲击。Rheodyne的不断流 (MBB) 专利设计,可以在断开旧的连接之前进行新的连接,从而保持流动的连续性。

描述 货号
7725型进样器 57620-U
7725i型进样器 57621
备用组件  
   VESPEL转子密封 58830-U
   Tefzel转子密封 57633
   定子面密封总成 57634
   针口清洗器 57635
   阀角支架(适用于所有金属Rheodyne阀门) 57636
   RheBuild套件,适用于7725/7725i/7726 55049
定量环(宽角度端口,含接头)  
   2 μL 57622
   5 μL 57623
   10 μL 57624
   20 μL 57625
   50 μL 57626
   100 μL 57627
   200 μL 57628-U
   500 μL 57629-U
   1 mL 57630
   2 mL 57631
   5 mL 57632

注意:使用VESPEL密封最高pH为10,Tefzel密封最高pH为14。 Supelco是Rheodyne的授权经销商。


优化技术泵备用零件

实施预防性维护计划,定期更换易磨损的泵部件,可助您避免代价高昂的停机。我们范围广泛的优化技术单向阀、密封件和活塞达到或超过了泵制造商的规格要求。有关最新泵零件,请参阅当前的Supelco产品目录,或致电我们的技术服务部。

SSI LO-Pulse阻尼器

脉冲阻尼器控制泵脉动以获得更稳定的基线。SSI LO-Pulse阻尼器已获专利,与单活塞往复式HPLC泵(Altex 110A、Eldex泵、LDC VS小型泵、SSI 200和SSI 300等)兼容。在500 psi至6000 psi(35-420 kg/cm²)的压力下,它可提高定量分析的精确度和痕量样品组分的检测极限。产品含接头和操作指南。

 

描述 货号
脉冲阻尼器 58455
无空气室的脉冲阻尼器 58442




Supelco溶剂回收系统

回收再用清洁的流动相,仅弃置受污染的流动相。

  • 降低溶剂购买和处置成本。
  • 节省资金和流动相制备时间,而且环保。

Supelco SRS-3000和SRS-1000溶剂回收系统可以在等分析中节省资金和时间。微处理器控制的溶剂开关阀监测检测器输出,并仅在检测到峰值时将溶剂引导至废液池。当基线低于所选的阈值时,未污染的溶剂将被引导回流动相储液罐。在典型的等度分析中,80-90%的流动相未被污染可以循环再用。通过设置阈值、检测范围和延迟时间,可以精确控制开关阀。除了以上提到的基本功能外,SRS-3000还提供验证报告(已含)、自动清洁选项(见下文)以及最多可存储10个方法文件的存储器。验证报告提供了溶剂回收阀位置的连续、可审计的数据跟踪,符合GMP、GLP或ISO-9000规程要求。通过单另在色谱信号副本上叠加刻度线来记录阀门位置。

自清洁(Autoclean)阀 — SRS-3000系统还配有可以让您选择不同溶剂来冲刷HPLC系统的阀门。如果您使用含缓冲液或其他盐的流动相的单泵,则自清洁阀特别有用。自清洁阀安装在流动相储液罐与泵之间。它有两条入口管线,一条用于流动相,一条用于洗涤溶剂。可以在工厂安装阀门,也可以单独订购并自行安装。

经济型装置 — 经剂型SRS-1000具有与SRS-3000相同的节省溶剂功能。其显示更简单,未配备高级功能(无验证报告、自清洁选项或方法存储内存),这使得其价格大幅降低。

两种系统均可即装即用 — 两种系统均包括带开关阀的控制单元、电源线、2芯信号电缆(+/-)、特氟隆管和接头以及使用指南。除了上述组件外,带有自清洁阀的SRS-3000系统还配备了清洗阀、额外的管和接头、清洗启动电缆和泵远程停止电缆。

SRS-3000和SRS-1000装置符合所有CE要求。

SRS-1000装置还符合UL和CSA要求。

安装简单

  1. 将SRS-3000或SRS-1000装置连接到检测器信号输出端(已附电缆)。
  2. 将SRS-3000或SRS-1000装置连接到流动相和废液池及检测器(已附特氟隆管)。
  3. 设置阈值,节省时间和金钱。

回收在等度分析中使用的80%或以上的流动相

描述 货号
SRS-3000溶剂回收系统1 57431
带自清洁功能的SRS-3000系统1 57432
用于SRS-3000装置的开关阀总成 57435
SRS-1000溶剂回收系统1  
   110 VAC 506125
   220 VAC 506133

1 经CE认证。


商标

FPLC — Amersham Pharmacia Biotech
Iso-Disc, Pelliguard, Sigma-Aldrich, Supelco, SUPELCOSIL, Supelguard, Trizma — Sigma-Aldrich Co.
LO-Pulse — Scientific Systems, Inc.
Rheodyne — Rheodyne, Inc.
Swagelok — Crawford Fitting Co.
Teflon — E.I. du Pont de Nemours & Co., Inc.

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