定量1H-NMR(qNMR)认证标准品

By: Christine Hellriegel, Senior Scientist NMR applications christine.hellriegel@sial.com, Alex Rück, Senior Scientist Certified Reference Materials alexander.rueck@sial.comAnalytiX Volume 10 Article 2

这是经定量核磁共振双重认证的新有机CRM相关的系列文章中的首篇。在本期中,我们将重点关注用作qNMR内参标准品的CRM,而在下一期的Analytix中,我们将展示第一批经过认证的有机色谱标准品

迄今为止,有机物质的含量或纯度通常使用色谱技术(如HPLC或GC)进行定量。在过去几年中,定量NMR(qNMR)不仅在制药工业,而且在许多其他领域中也得到了发展。

在Sigma-Aldrich® (Buchs,瑞士)的研发实验室最近安装了一台新的Bruker Avance III 600 MHz核磁共振光谱仪,用于有机物质的高分辨率qNMR测量。截至2009年底,新的核磁共振实验室完全通过了ISO / IEC 170251 以及ISO指南342 的认证,从而使用1H-qNMR进行有机参考物质的认证。能够通过两种认证代表了可实现的最高可靠性水平,并在CRM生产商中获得了“黄金标准”的称号。

我们正在推出一套用作qNMR内参标准品的首系列新CRM校准标准品。这些CRM通过qNMR和其他技术进行全面表征,从而确保高精度和极低的认证不确定性。所有这些qNMR参比物质都来源于NIST的国际认可参比物质,并且每个CRM都会提供详细的证书。


 qNMR测量的性能和优势

在有机物质的定量或纯度测定方面,定量核磁共振相比其他分析技术展现了不少优势。其最突出的特性是它是一种相对直接的方法:信号强度与提供共振的质子数成正比。因此,其结果与化学物质的结构无关。此外,经验因素或未知的偏差对信号的比率没有显著的影响。因此,可以非常精确地测量两个不同质子的信号比,并且唯一对测量不确定性有重要影响的是信号的积分。换句话说,qNMR实验的直接响应具有最高的准确性。

 当然,为了获得良好的qNMR结果,必须满足一些基本要求。首先,必须以最高精度完成qNMR测量之前参比和样品的称重,因为这是qNMR分析中必不可少的样品制备步骤。因此很自然,必须提供合适的内部校准参考物质(参见下一节)。此外,参考物质和样品不得发生相互反应或与溶剂发生反应。选择进行测量的相关信号必须彼此清楚地分开,并且同时需要与其他信号清楚地分开。需要适当的仪器设置,以便在不完信号弛豫时不会损失信号强度。


 对qNMR校准标准品的要求

由于NMR信号强度完全不受物质的性质影响,因此许多有机物质都可作为qNMR的内参。实际上,qNMR合适的候选参比的数量相当有限,因为它们必须符合以下一系列特定要求:只有信号峰数量非常有限且有机纯度最高的物质才适合作为qNMR的参比。候选物质必须在溶液中稳定,不应具有化学反应性。它们不应含有残留水,因为在许多情况下,水的存在会导致谱线增宽或基线变形。当然,为了确保准确的称量结果,固体qNMR参比不应该具有吸湿性,液体qNMR参比不应该具有挥发性。等时质子核的数量需要是最佳的,即,相对于qNMR参比物质的分子量来说,其数量既不太高也不太低,因为样品和内参的1:1信号强度比是我们的目标。否则,会导致一次测量所用的物质量可能太低(导致称重结果不好)或太高(导致溶解度问题)。qNMR参比的信号不应覆盖谱图中所分析物质的最常见预期信号的区域。最后,qNMR参比物质既不应具有剧毒性,也不应具有致癌性或致突变性。

 很显然,必须有许多不同的qNMR标准品来涵盖各种分析物和氘代溶剂。我们开发了一系列qNMR参比物质,并且每种参比物质都有其独特的溶解性能和化学位移。全新的qNMR校准标准品的选择请参见 图1 (水溶性标准品)和 图2 (可溶于非极性有机溶剂的标准品)。

图1 水溶性qNMR标准品的1H NMR波谱。HDO的残留信号被部分抑制

图1 水溶性qNMR标准品的1H NMR波谱。HDO的残留信号被部分抑制

图2 溶于有机溶剂的qNMR标准品的1H NMR波谱。

图2 溶于有机溶剂的qNMR标准品的1H NMR波谱。


 qNMR校准标准品的认证

为了达到上述所有要求,经过认证的全新系列qNMR参比物质已经过一系列预测试和广泛的认证测量,以符合ISO/IEC 17025和ISO Guide 34的要求。只有经过精心采购或纯化,并通过色谱、LC-MS和其他标准技术进行了广泛表征的高纯度物质,才能够用于进行qNMR认证过程。

  • 预测试:测试该物质的吸湿性或挥发性、在不同氘代溶剂中的稳定性、以及相对于NIST认证的参比物质来说(> 24小时)的反应性。
  • 稳定性测试:在较高温度下储存后进行重复测试以确保即使在极端的运输条件也不会影响其相关认证值(> 1个月)。在建议的储存温度下的老化研究数据可用于确定产品的保质期(> 3年)。
  • 信号适用性测试:由于只有“纯”的信号才能用于进行NMR定量(没有重叠且没有潜在的杂质信号),因此需要进行大量的2D实验(在某些情况下,需要进行H-H COSY和C-H相关实验)。通过H-H COSY实验,可以很容易地检测到来自杂质的隐藏信号,检测限低于0.1%(参见下面 图3的示例)。该适用性检测需要在开始认证测量之前进行。
  • 同质性和可追溯性:从批次内的不同位置取10个样品。然后通过使用超微量天平在一个小瓶中称量相同重量的qNMR物质和NIST参比物质来制备NMR样品。进一步将样品进行溶解,并按标准化的测量设置在Bruker Avance III 600MHz NMR仪器上进行测量和分析样品。在进行差异分析之后,进行详细的不确定度概算,并将所有数据汇总在综合证书中。

图3 3,5-二硝基苯甲酸的2D COSY图谱:虽然杂质的相对含量低于0.1%,但仍可以确定杂质3-硝基苯甲酸的交叉峰。

图3 3,5-二硝基苯甲酸的2D COSY图谱:虽然杂质的相对含量低于0.1%,但仍可以确定杂质3-硝基苯甲酸的交叉峰。

 通过该质量程序,可获得大多数纯度 ≥ 99.5%的qNMR参比物质,并且具有≤ 0.2%的典型不确定性。所有qNMR标准品均采用棕色玻璃瓶包装,并用密封盖密封。每个CRM都提供符合ISO指南31的详细证书。该证书包含一个综合文档,其列出特定批次的相关数值、可追溯性、不确定性计算、保质期、以及存储信息。

由于qNMR相较于其他分析技术有许多优势,Sigma-Aldrich® 将推出一系列经过认证的有机色谱有机标准品,这些CRM的认证数值不仅会通过HPLC或GC进行测定,同时还会经qNMR进行测定。


 参考文献

  1. ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
  2. ISO Guide 34, General requirements for the competence of reference material producers.