产气荚膜梭菌、其性质及检测

来源:ivo.siegrist@sial.comAnalytiX Volume 10 Article 4

产气荚膜梭菌的作用及其检测、鉴定和分化
微生物学产品经理

梭菌是相对较大的革兰氏阳性杆状细菌,只能进行无氧代谢。大多数梭菌不能在有氧条件下生长,因此可以通过暴露于O2来杀死这种细菌。然而,它们形成的内生孢子能够长时间暴露在空气和其他不利的环境条件下存活。梭菌的天然来源是具有有机营养素的厌氧生境,特别是土壤、水沉积物和动物的肠道。它们发酵有机化合物(如糖)时会产生大量的CO2和H2以及挥发性有机化合物,如乙酸、丁酸、丙酮和丁醇。氨基酸和脂肪酸等底物的代谢导致恶臭的降解产物。梭菌还具有更广泛的细胞外酶,其将环境中的大生物分子降解为可发酵化合物。虽然存在非致病性梭菌,但该菌属产生一些最强的生物毒素。这些毒素中三个特别致命的成员是产气荚膜梭菌,其导致与熟肉相关的食物中毒以及导致气性坏疽的伤口和外科感染;导致致命破伤风感染的破伤风梭菌;以及导致肉毒中毒的肉毒杆菌。

产气荚膜梭菌存在于未煮熟或未适当消毒的罐头食品(内生孢子萌发)和水(地表水)中。天然污染源是人和动物粪便,主要通过水传播到食物中。产气荚膜梭菌产生广泛的侵袭素和外毒素。肠毒素造成不希望的、主要与肉食相关的食物中毒和导致气性坏疽的伤口和手术感染。

产气荚膜梭菌在水质检测中起辅助作用4。梭菌是孢子制造者,耐高温、氯化和其他应激因素。与抵抗能力较低的营养细胞如大肠菌(大肠杆菌、肠球菌)相比,产气荚膜梭菌存活时间更长6。因此,虽然粪便污染主要通过大肠杆菌作为指示剂检测到,其可能在处理步骤后消失,但产气荚膜梭菌仍然存在。该有机物本身不是水中的危害;但当水与食物接触时即成为问题。

考虑到上述事实,显然产气荚膜梭菌的检测和鉴定是控制和根除这种有效病原体的重要步骤。产气荚膜梭菌的一些特征酶是溶血素(β-溶血)、卵磷脂酶、细胞外蛋白酶、脂酶(磷脂酶-C)、胶原酶、透明质酸酶、糖分解酶和将亚硫酸盐还原为硫化物的酶。这些酶也用作检测和分化靶标。还值得注意的是,产气荚膜梭菌是一种非运动细菌,它是还原亚硫酸盐的梭菌中最重要的一种。此外,产气荚膜梭菌通常在44°C生长,而其他一些梭菌在此温度下受到抑制。此属性用于ISO方法,使培养基更具选择性4

为了检测产气 荚膜梭菌,已推荐使用mCP和TSC琼脂4,5。然而,这些培养基存在一些问题。mCP方法在常规筛选中工作非常繁重,并且细菌菌落不能用于进一步的生化测试。此外,ISO拒绝回收产气荚膜梭菌,转而采用基于TSC琼脂的方法6。然而,TSC不仅仅只检测出产气荚膜梭菌,而且还检测出所有还原亚硫酸盐的梭菌;在某些情况下,琼脂过度变黑使得难以对较低稀释度计数。另一方面,如果污染太高,TSC不能始终如一地产生黑色菌落,结果,菌落的白色给出了假阴性结果。

为了防止这个问题,Sigma-Aldrich推出了一种名为CP ChromoSelect琼脂的新培养基,这是一种新一代显色培养基。研究表明,这种培养基产生的计数与从其他培养基中获得的计数没有显著差异。从所有培养基中分离的典型和非典型菌落的鉴定已经证明,CP ChromoSelect琼脂(参见图1)对于水样品中的产气荚膜梭菌比mCP(参见图2)和TSCF琼脂更具特异性。

 

在硅片上生长的产气荚膜梭菌的扫描电子显微照片

图1. 在硅片上生长的产气荚膜梭菌的扫描电子显微照片(来源:S.  Melville,弗吉尼亚理工大学生物科学系)
 

CP ChromoSelect琼脂

图2. CP ChromoSelect琼脂(产气荚膜梭菌显示为绿色菌落)

为了控制产气荚膜梭菌,Sigma-Aldrich开发了多种选择性培养基(表1)、测试(表23)和厌氧设备(表4),用于检测、鉴定和分化梭菌。

货号 描述
17170 AEA孢子形成肉汤(基础),经改良
15997 布鲁尔琼脂
27544 梭菌分化肉汤
27546 梭菌营养培养基
12398 CP ChromoSelect琼脂
G0289 明胶铁琼脂
61348 乳糖明胶培养基(基础)
75605 m-CP琼脂基础
14305 运动性硝酸盐培养基
70151 营养明胶
39727 产气荚膜杆菌琼脂基础
91365 增强型梭菌琼脂
85627 SPS琼脂
17231 SPS琼脂,经改良
86128 亚硫酸盐铁琼脂
T3938 不含葡聚糖的胰蛋白胨黄豆肉汤
93745 TSC琼脂
93735 TSN琼脂

表1. 产气荚膜梭菌的常用和新型培养基(梭菌培养基的完整清单可在sigma-aldrich.com/clostridia上找到)
 

梭菌诊断测试 货号 描述
氨肽酶测试 75554 用于检测主要存在于革兰氏阴性微生物中的L-丙氨酸 - 氨肽酶。
Kovac吲哚试剂(异戊醇作为溶剂)

67309 用于分化梭菌。在氧气存在下,一些细菌能够将色氨酸分解成吲哚和
Kovac吲哚试剂(丁醇作为溶剂)

60983 α-氨基丙酸。产气荚膜梭菌是一种吲哚阴性细菌。
甘露醇圆片 94438 用于基于甘露醇发酵来分化细菌。
硝酸盐试剂圆片 08086 用于检测生物体还原硝酸盐的能力。
三丁酸甘油酯条 75744 测试原理是三丁酸甘油酯的水解。
 该反应造成酸碱指示剂变色。

表2. 用于鉴定和分化梭菌的测试
 

革兰氏染色 货号
革兰氏染色试剂盒 77730
革兰氏结晶紫溶液 94448
革兰氏脱色剂溶液 75482
革兰氏品红溶液 87794
革兰氏碘溶液 90107
革兰氏番红溶液 94635
表3. 革兰氏染色试剂盒及单独的溶液
 
厌氧设备
货号
厌氧大气发生袋 68061
厌氧指标测试 59886
厌氧罐 28029
表4. 厌氧设备
 

有关梭菌和许多其他病原体的培养基、测试及设备的详情,请访问我们的网站:sigma-aldrich.com/microbiology

 

 材料

     

 参考文献

  1. Sherris Medical Microbiology, 4th ed., K.J. Ryan and C.G. Ray Editors, McGraw Hill, 2004.
  2. Wells, C. L..; Wilkins, T. D., Clostridia: Sporeforming Anaerobic Bacilli, In Baron’s Medical Microbiology, 4th ed., S. Baron Editor, Univ. of Texas Medical Branch, 1996.
  3. Elmer Koneman, W. et al Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 5th ed., Lippincott Williams & Wilkins, 1997.
  4. ISO 6461 Part 2. Water Qualily – detection and enumeration of Clostridium perfringens. (Revision of ISO 6461-2: 1986).
  5. Council Directive 98/83/EC, Relating to the Quality of Water Intended for Human Consumption, Official Journal of the European Communities, p.L330-32-L330/53 (1998).
  6. National Standard Method, Enumeration of Clostridium perfringens by membrane filtration, issue no 3.1, reference no W5i3.1 (2005).