微阵列实验中用于标记DNA的荧光染料的性质分析

作者:Dr. Jens Sobek, Catharine Aquino, Dr. Ralph Schlapbach,BioFiles 2007, 2.5, 5.

BioFiles 20116.3, 9.

Dr. Jens Sobek, Catharine Aquino, Dr. Ralph Schlapbach, Functional Genomics Center Zurich, Zurich, Switzerland

Cy3和Cy5是常用于微阵列分析的荧光染料。这两种染料有一些有用的特性,包括相对高的荧光量子产率和最小的光谱重叠,这使得它们适用于多重检测应用。然而,与最近开发的染料相比,Cy染料和衍生物具有较低光稳定性。

我们研究的目的是,在检测寡核苷酸阵列时,将Cy5染料替代为具有下列特性的染料:(1)更稳定,而且(2)在微阵列实验中提供更高的荧光信号。在这项研究中,我们开发了一个模型系统,使我们能够研究与载玻片表面杂交的寡核苷酸-染料缀合物的荧光特性和稳定性,而无需再做费时费力的样品制备。为了降低实验的复杂性,我们仅对少数寡核苷酸进行了点样,对每个载玻片只杂交一种染料标记的互补寡核苷酸,。在这里,我们将给出初步结果,将成熟的蓝色吲哚羰花青染料Cy5、DY-647和Alexa Fluor® 647与有前景的候选产品Atto 633和Atto 647N进行比较。完整研究的结果将在别处发表1


 实验细节

材料

在这项研究中,使用了共享共同的13聚体结合区的三个71聚体寡核苷酸(Operon, Cologne, Germany)。共同的13聚体区域位于寡核苷酸的近端3'末端(71近端),靠近中心(71中心),或者位于远端5'末端(71远端)。含有与71聚体中的结合区互补的序列(ON)的13聚体寡核苷酸-染料缀合物(5'-染料-TGCCTGAAGCTAT;ON-染料)由Proligo(Hamburg, Germany)(Atto 633,Atto 647N)、Microsynth(Balgach, Switzerland)(Cy5)、Dyomics(Jena, Germany)(DY-647)和IBA(Göttingen, Germany)(Alexa Fluor 647)合成。在寡核苷酸合成后,除了Cy5之外的所有染料在另一个反应中通过氨基己基接头作为NHS酯掺入。为了掺入Cy5,使用了来自Glen Research(Sterling,VA,USA)的亚磷酰胺结构单元。将水去离子并使用Milli-Q® 合成A10纯化系统过滤。所有寡核苷酸均通过HPLC纯化。氯化钠(分子生物学级)、HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸],> 99.5%)、柠檬酸三钠(> 99%)、盐酸(p.a.)和十二烷基硫酸钠(> 98%)均来自Sigma(Buchs, Switzerland)。

阵列的生成

使用sciFLEXARRAYER(Scienion,Berlin,Germany)和PiezorrayTM(Perkin Elmer,Downers Grove,IL,USA)非接触式分配仪器生成微阵列。三个71聚体寡核苷酸(71近端、71中心和71远端)在3×盐水-柠檬酸钠缓冲液(SSC)中连续稀释(20、10、5和2.5 μM),然后在环氧硅烷包被的载玻片(Scienion,Berlin,Germany)上重复点样15次(每个点1.5 nL)。室温下在湿度室中孵育过夜,以使寡核苷酸固定在载玻片表面上2

杂交

洗涤、封闭、杂交和干燥步骤在自动杂交站(HS4800,Tecan,Salzburg,Austria)中进行,同时可以杂交12个载玻片。将13聚体寡核苷酸-染料缀合物的50 nM溶液在30℃下在HEPES / SSC / SDS中与4个副本载玻片杂交2小时。杂交后,将载玻片在23℃的非严格条件下依次用2× SSC / 0.2% SDS、0.2× SSC / 0.2% SDS和0.2× SSC洗涤。然后在杂交站中用氮气干燥载玻片以避免接触空气。干燥后,将载玻片快速转移到充有氮气的塑料袋中,以将空气暴露时间减少到10-15秒。进入袋子后,立即将载玻片用空白玻璃载玻片覆盖,以保护微阵列表面上的染料免受空气中存在的臭氧和其它氧化剂的降解

染料稳定性的测定

为了确定染料稳定性,将载玻片在氮气下扫描12次。我们使用了附近的环境监测站(Stampfenbachplatz,Zurich)提供的数据来估算大气臭氧浓度。为了与这些值相关联,我们用分光光度计测量了一次我们实验室的大气臭氧浓度3。我们发现,我们实验室的臭氧浓度是Stampfenbachplatz测量浓度的约75%。

扫描和数据分析

使用Tecan LS400激光扫描仪在相同条件下扫描所有载玻片。用盖玻片保护阵列,扫描时杂交面朝下。将扫描仪焦点设置在载玻片的下侧,透过玻璃测量荧光。使用Array-Pro® Analyzer 4.5.1软件(Media Cyber​​netics,Silver Spring,MD,USA)评估扫描结果。报告的平均荧光强度值是由四个副本载玻片计算而得。

吸收和荧光光谱

使用Tecan Safire2TM光谱仪在1× SSC中获取了吸收和荧光光谱。荧光在600 nm激发,并在溶液表面检测(顶部读数模式)。

 

吲哚羰花青和碳罗丹明染料的化学结构。

图1. 吲哚羰花青和碳罗丹明染料的化学结构。

吸收和荧光光谱

结果及讨论

所评估的染料的分子结构如图1所示。核心生色团结构与传统的吲哚羰花青染料Cy5、DY-647和Alexa Fluor 647的相同。这些化合物的不同之处在于烷基的类型和位置以及磺酸基团的数量,其影响核心的总电荷(对于三种染料分别为+1、-1和-3)。Atto 633和Atto 647N属于碳罗丹明类染料,两者都带有+1电荷5

所有五种染料的吸收和荧光光谱如图2所示。光谱分析将在即将出版的出版物中给出1

寡核苷酸染料缀合物

图2. 寡核苷酸染料缀合物(ON-染料)的吸收(A)和荧光(B)光谱。

荧光强度

与ON-Atto 647N杂交的载玻片的典型图像显示在图3中。在与三个71聚体寡核苷酸探针杂交后,测量了每种寡核苷酸-染料缀合物的相对荧光强度,测量中使用了四个副本载玻片上的15个重复点样点,然后对每个缀合物的数据取平均值(参见图4)。

荧光数据的分析显示出不均匀的图案。观察到寡核苷酸-染料缀合物ON-Cy5和ON-Atto 647N杂交至71远端(参见图4A)和71中心(参见图4B)时信号最强。发现ON-Cy5和ON-Atto 647N的最大强度比其他三种缀合物高约50%。此外,五种ON染料之间的信号强度存在很大差异,特别是当与71远端杂交时,这些差异与染料电荷相关。带正电荷的染料(Cy5、Atto 633和Atto 647N)产生比DY-647(电荷-1)和Alexa Fluor 647(电荷-3)更强的荧光信号。当与71近端杂交时,所有五种寡核苷酸-染料缀合物都具有差不多的荧光强度(参见图4C)。

为了研究染料电荷对信号的影响,在杂交步骤中使用5× SSC / 0.1% SDS缓冲液在23℃下进行了第二组杂交。在这些不太严格的条件下,在与三个71聚体杂交后,观察到给定染料标记的13聚体的荧光强度没有差异(数据未显示)。荧光强度与染料电荷相关,Cy5和Atto 647N缀合物再次产生最高强度,而带负电荷的染料DY-647和Alexa Fluor 647染料的荧光强度则比其低达60%。

数据表明,30℃下荧光强度的差异是由于与染料负电荷的相互作用所造成的寡核苷酸杂合体的去稳定化。Wagoner和其他人在胸腺嘧啶的C-5位用Cy3多重标记的27聚体寡核苷酸中6,以及在用荧光素和曙红骨架标记的24-聚体中7,或者用附着于9聚体位置2上的罗丹明骨架标记的24聚体中8,观察到这种杂合体去稳定化。然而,就我们所知,由附着于寡核苷酸一端的标记染料造成的去稳定相互作用以前没有报道过。

我们的结果表明,对于使用短寡核苷酸的应用,推荐使用带正电荷的标记染料(例如Cy5、Atto 647N、Atto 633),以避免所观察到的去稳定作用。

用共聚焦显微镜测量的荧光图像。点到点距离为500 μm。

图3. 用共聚焦显微镜测量的荧光图像。点到点距离为500 μm。

 寡核苷酸-染料缀合物

 

图4. 寡核苷酸-染料缀合物(ON-染料)与固定在环氧硅烷包被的表面上的互补71聚体寡核苷酸(A:71近端,B:71中心,或C:71远端)杂交后的荧光强度。

染料稳定性研究

许多在长波长吸收的标记染料都存在局限性,尤其是花青染料,包括Cy5、DY-647和Alexa Fluor 647,光稳定性低是它们固有的问题,而且大气臭氧也会增强它们的降解9。如果在扫描载玻片的过程中存在较高的臭氧浓度,会造成染料快速降解,从而可能导致数据无效。在苏黎世,在冬季和夏季分别测量到10-30 ppb和10-75 + ppb的臭氧浓度4。在最高臭氧浓度下,未受保护的载玻片只要暴露几分钟,即可导致吲哚羰花青染料显著降解。

为了比较染料的稳定性,我们进行了两组实验。首先,为了确定光稳定性,杂交载玻片被扫描了12次。由于光降解随着臭氧浓度的增加而强烈增加,我们使用保护盖玻片在氮气下扫描载玻片(参见实验细节)。其次,将另一批杂交载玻片在环境实验室条件下存于黑暗处,并分别暴露于含有~15 ppb臭氧的空气中30分钟,以及含有30 ppb臭氧的空气中150分钟。在氮气下,在该处理之前和之后扫描载玻片10

扫描载玻片12次后,导致信号发生3%至9%的降解,Atto 647N所表现出的降解最少(见图5)。对于Cy5和Atto 633,观察到最显著的信号强度降低。

辐射造成的染料降解

图5. 辐射造成的染料降解。将杂交的载玻片扫描12次。绘制第一次和最后一次扫描的荧光强度比率。为了排除臭氧的影响,在氮气下扫描载玻片。

花青染料暴露于臭氧对表面染料的荧光强度有巨大影响(见图6)。将ON-Cy5暴露于相对低的臭氧浓度(15 ppb)30分钟导致荧光强度损失30%。在这些条件下,磺化染料(ON-DY-647和ON-Alexa Fluor 647)更稳定。在较高的空气臭氧浓度(30 ppb)和长时间暴露(150分钟)时,信号强度分别降低75%(Alexa Fluor 647)、79%(DY-647)和89%(Cy5)。Atto染料仅显示出轻微的荧光强度损失,Atto 647N降低了9%,Atto 633降低了不到1%。我们甚至观察到基于碳罗丹明的Atto染料的荧光强度在最初还有所增加。

大气臭氧对荧光强度的影响

图6. 大气臭氧对荧光强度的影响。将杂交的载玻片在黑暗中暴露于A)15 ppb(30 μg/m3)的臭氧浓度下30分钟,以及B)25 ppb(50 μg/m3)下150分钟。在暴露之前和之后测量强度。


 结论

我们测量了五种寡核苷酸-染料缀合物与固定在微阵列玻璃表面上的三种71聚体寡核苷酸杂交后的相对荧光强度和稳定性。我们观察到荧光强度与染料的总电荷相关,带更多负电荷的染料产生较低的荧光强度。我们将此归因于染料使杂合体不稳定。当在需要具有低熔融温度的寡核苷酸的应用中,该信息可能对染料的选择具有价值。

所有测试的染料当受到保护不暴露于大气臭氧时,在适当的激发波长下重复扫描的结果都表明它们具有足够的稳定性。Atto 633和Atto 647N在暴露于臭氧时,表现出微小的荧光信号损失,在这方面,它们最适合作为微阵列应用中的标记染料。我们知道这项研究的结果并不表明这些染料可以多么成功地应用于二抗DNA与氨基烯丙基取代的核苷酸之间的标记反应以及随后的杂交反应。进一步的工作仍在进行当中。


 参考文献

  1. Sobek, J., Aquino, C., Schlapbach, R., to be published.
  2. Sobek, J., Aquino, C., Schlapbach, R., Quality Considerations and Selection of Surface Chemistry for Glass-Based DNA, Peptide, Antibody, Carbohydrate, and Small Molecule Microarrays. Microarrays. Volume II, Applications and Data Analysis Series: Methods in Molecular Biology. Rampal, J.B. (Ed.), 2nd ed., Humana Press (2007).
  3. Many thanks to Dr. Jürg Brunner (Environment and Health Protection of the City of Zurich) for performing the measurements.
  4. http://www.stadtzuerich.ch/internet/ugz/home/fachbereiche/luftqualitaet/ messwerte/tagesverlauf.html
  5. Thanks to Prof. Karl-Heinz Drexhage, ATTO-Tec (Siegen, Germany), for information on the compounds.
  6. Randolph, J. B., Waggoner, A. S., Stability, specificity and fluorescence brightness of multiply-labeled fluorescent DNA probes. Nucl. Acids Res., 25, 2923–2929 (1997).
  7. Ozaki, H., McLaughlin, W., The estimation of distances between specific backbone-labeled sites in DNA using fluorescence resonance energy transfer. Nucl. Acids Res., 20, 5205–5214 (1992).
  8. Aurup, H., Tuschl, T., Benseler, F., Ludwig, J. , Eckstein, F. Oligonucleotide duplexes containing 2'-amino-2'- deoxycytidines: thermal stability and chemical reactivity. Nucl. Acids Res., 22, 20–24 (1994).
  9. Fare, T.L., et al., Effects of atmospheric ozone on microarray data quality. Anal. Chem., 75, 4672–4675 (2003).
  10. The dyes are stable for several weeks when slides are stored in the dark under a nitrogen atmosphere.

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