细胞活力和增殖测定

来源:Article Based on, BioFiles v6 n5, 17–21

  细胞活力和增殖测定的引言

细胞增殖、细胞活力和细胞毒性的测定通常用于监控培养细胞在受到各种刺激后的应激反应和健康状况。测定方法的选择取决于所用的细胞数量和类型以及所预期的结果。细胞增殖测定可监控随时间变化的细胞数量、细胞分裂次数,代谢活性或DNA合成。使用台盼蓝或Calcein-AM等活力染料进行细胞计数,可得出增殖速率以及活细胞的百分比。


细胞活力和增殖测定概述

 

名称 概述 检测方法 优点  缺点
BrdU 测定 BrdU掺入到新合成的DNA中,并使用抗Brdu抗体进行检测。 ICC, IHC, FACS, ELISA  细胞周期动力学 
单细胞分辨率
实验方案冗长 
有损伤DNA的可能
EdU 测定 与BrdU技术类似,但使用无抗体的点击化学检测方法 
 
ICC, IHC, FACS, ELISA 比BrdU毒性低 
实验方案较快 
无DNA变性
试剂昂贵
MTT 测定 MTT是一种黄色四唑,在活细胞中被还原成蓝紫色甲䐶 
 
分光光度计 实验方案快 
高通量
终点测定 
高估活性 
最终溶解步骤
XTT测定 主动呼吸的细胞将XTT转化成水溶性橙黄色甲䐶产物 
 
分光光度计 高灵敏度 
大动态范围 
溶于水
终点测定 
高估活性 
 
WST-1 测定 WST-1通过主要在细胞表面发生的复杂细胞机制被切割成水溶性的甲䐶。 
 
分光光度计 灵敏度最高 
实验方案较快
终点测定 
高估活性 
 
Ki67 Ki-67核蛋白的抗体可用于测量细胞增殖。 ICC、IHC、WB 体内应用  难以量化 
需要固着
CFSE CFSE是一种非荧光、细胞可渗透染料,被细胞内酯酶切割,产生绿色荧光。 ICC, FACS  活细胞分析 
实验耗时长 
与淋巴细胞相容
毒性 
绿色通道排放
活细胞/死细胞测定 Calcein-AM(染色活细胞)和碘化丙啶(PI)(染色死细胞)一起使用,同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。 ICC, FACS  活细胞分析 
实验方案快 
单细胞分辨率
背景自发荧光
台盼蓝 染料排除测试基于活细胞不吸收非渗透性染料,而死细胞则是可渗透的且吸收染料。  显微 成本低 
实验方案快 
 
差异性 
不准确
β-gal 在不增殖的衰老细胞中可以检测到β-半乳糖苷酶(β-Gal)酶活性。 IHC  成本低 
实验方案快 
 
难以量化 
终点测定

 

 DNA合成增殖测定

BrdU细胞增殖测定

可以通过监测放射性同位素[3H]-胸苷掺入细胞DNA,然后进行放射自显影来研究细胞增殖。或者,可以使用5-溴-2'-脱氧尿(BrdU测定)代替胸苷。使用抗BrdU的单克隆抗体,以及酶-或荧光染料-缀合的二抗,可以容易地检测到已将BrdU掺入DNA的细胞。

BrdU细胞增殖测定

图 1. A. 使用BrdU染色增殖E4鸡胚眼中的细胞。B. 使用喜树碱进行抗BrdU抗体验证。通过用细胞周期阻滞剂喜树碱处理Jurkat细胞,循环细胞被阻滞在G1/S时相转换点。

EdU增殖测定

Baseclick EdU增殖测定提供一种高效的荧光检测DNA复制的方法。将修饰后的核苷EdU添加到活细胞中,并掺入到复制DNA中。Cu诱导的点击化学允许荧光探针快速附着到EdU。这为监测正在增殖的细胞提供了定量方法。测定有多种形式,可用于显微镜成像、流式细胞术、高通量筛选和体内实验。有四种不同的荧光探针可以在488、555、594和647附近激发,因此读数可以与其他荧光探针多路复用。

Edu-Click细胞增殖试剂盒

图 2. Edu-Click细胞增殖试剂盒在活性DNA合成期间将EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)掺入DNA中,并使用点击化学荧光检测法测量。


 代谢增殖测定

测量代谢活性的测定适用于分析细胞增殖、活力及毒性。四唑盐,如MTT、 XTT、 WST-1,至有色甲䐶化合物的还原反应,或刃天青的生物还原反应,仅发生在代谢活性细胞中。活跃增殖的细胞提高其代谢活性,而暴露于毒素的细胞则活性下降。

MTT细胞增殖测定

MTT(3- [4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物;噻唑基蓝)是水溶性四唑盐,当在缺乏酚红的培养基或盐溶液中制备时产生淡黄色溶液。通过脱氢酶切割四唑环,溶解的MTT被转化为不溶的紫色甲䐶。可以用异丙醇或其他溶剂溶解这种非水溶性甲䐶,并通过分光光度法测量溶解物,吸光度是转化的染料浓度的函数。

XTT细胞增殖测定

与MTT相反,XTT的切割产物可溶于水,因此,不需要溶解步骤。四唑盐XTT通过复杂的细胞机制被切割为甲䐶。该生物还原反应仅在活细胞中发生,并且与通过糖酵解产生的NAD(P)H有关。因此,形成的甲䐶染料的量直接与培养物中代谢活性细胞的数量直接相关。

WST-1 细胞增殖测定

稳定的四唑盐 WST-1 通过主要在细胞表面发生的复杂细胞机制被切割为可溶性甲䐶。该生物还原很大程度上取决于活细胞中NAD(P)H的糖酵解生产。因此,形成的甲䐶染料的量直接与培养物中代谢活性细胞的数量直接相关。

MTT测定是基于代谢活性来评估细胞增殖的比色测定法

图 3. MTT测定是基于代谢活性来评估细胞增殖的比色测定法。依赖于NAD(P)H的细胞氧化还原酶反映存活细胞的数量。这些酶能够将黄色四唑染料MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物还原成不可溶的紫色甲䐶。


 荧光染料增殖测定

CFSE标签

5(6)-羧基荧光素二乙酸酯N-琥珀酰亚胺酯(CFSE)是测量细胞群所经历的细胞分裂次数的常用方法。进入细胞后,CFSE被细胞内酯酶切割形成荧光化合物,并且琥珀酰亚胺酯基团与细胞内蛋白质上的伯胺发生共价反应。在分裂时,每个子代细胞的荧光强度减半,这使得细胞分裂次数可轻易地被流式细胞仪检测到。CFSE已被广泛地用于测量淋巴细胞和t细胞的增殖。

活细胞/死细胞双染色

活细胞/死细胞双染色可用于同时为活细胞和死细胞进行荧光染色。Calcein-AM是一种高度亲脂性胞膜可渗透染料。虽然    Calcein-AM本身不是荧光分子,但是它在活细胞中通过酯酶产生钙黄绿素,发出强烈的绿色荧光(λex 490nm,λem 515nm)。因此,Calcein-AM仅染色活细胞。而细胞核染色染料碘化丙锭不能穿透活细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域到达细胞核,并插入细胞的DNA双螺旋,发出红色荧光(λex 535nm,λem 617nm)。由于钙黄绿素和PI-DNA都可以用490 nm光激发,因此可以使用荧光显微镜同时监测活细胞和死细胞。

 


 台盼蓝活性测定

台盼蓝排除法

台盼蓝是用于活细胞计数染料排除法的几种推荐染料之一。该方法的原理是,活(可存活)细胞不吸收某些染料,而死(非存活)细胞则吸收。染色帮助将细胞形态可视化。

注意:台盼蓝对血清蛋白的亲和力高于对细胞蛋白的亲和力。如果背景过暗,则应在计数前将细胞沉淀并重悬于无蛋白质的培养基或盐溶液中。

台盼蓝实验方案

  1. 在平衡盐溶液(例如汉克平衡盐溶液[HBSS],货号H9269)中制备细胞悬液。
  2. 将0.5 ml 0.4% 台盼蓝溶液 (w/v) 转移到试管中。加入0.3 ml HBSS和0.2 ml细胞悬液(稀释因子 =  5)并充分混合。静置5至15分钟。
    注意:
    如果细胞长时间暴露于台盼蓝,活细胞和非活细胞都可能开始吸收染料。
  3.  盖好盖玻片,用巴斯德吸管或其他合适的装置吸取少许台盼蓝细胞悬液混合物,转移到血细胞计数板的两个计数区内。用移液管吸头小心地接触盖玻片的边缘,借助虹吸作用将每个计数区充满。请勿将计数区注入太多或太少液体。
  4.  从血细胞计数板的计数区 1开始,计数中间1 mm的方格和四角的1 mm方格中的所有细胞。非活细胞会染成蓝色。活细胞和非活细胞应单独计数。
    注意:每个方格外周的压线细胞只计上侧和左侧的, 不计下侧和右侧的压线细胞。
  5.  对计数区2重复此过程。注意:如果有超过10%的细胞成簇,则在原始细胞悬液以及台盼蓝细胞悬浮液混合物中用力移液,使细胞散开,然后重复整个计数过程。如果在10个方格中观察到少于200个或多于500个细胞(即20-50个细胞/格),则调整至适当的稀释倍数,然后重复计数过程。
  6.  撤出第二个样本并重复计数过程以确保准确性。


 计算

细胞计数 — 血细胞计数板的每个方格,加上盖玻片后总体积为0.1 mm3 或10-4 cm3。由于1 cm3 相当于约1 ml,因此将使用以下计算确定随后的每ml细胞浓度(和细胞总数):

每mL细胞数 = 每格的平均数 × 稀释倍数 × 10(计数10格)

例:若每格的平均计数为45个细胞,
则为45 × 5 × 104 = 2.25 × 106 个细胞/ml。

总细胞数 = 每mL细胞数 × 除去细胞样品后的原始液体体积。

例: 2.25 × 106 (细胞/ml) × 10 ml (原始体积) = 2.25 × 107 个总细胞数。

细胞成活率(%)= 总活细胞数(未染色)÷ 总细胞数(染色和未染色)×100

例:如果每个方格未染色(活)细胞的平均计数为37.5,则总活细胞数 = [37.5 × 5 × 104] 个活细胞/ml × 10ml(原始体积)= 1.875 × 107 个活细胞。细胞成活率(%)= 1.875 × 107 (活细胞数)÷ 2.25 × 107 (总细胞数)×100 = 83%成活率


 使用血细胞计数板计数细胞

使用血细胞计数板计数细胞

图 4. 圆圈表示在100倍显微镜放大倍率(10倍目镜和10倍物镜)下覆盖的近似区域。压线细胞只计上侧和左侧的(O), 不计下侧和右侧的(Φ)。计数两个计数区的4角的方格和中央方格中的细胞数(图中仅显示了一个计数区)。


 材料

     

 参考文献

T Mosmann
Journal of Immunological Methods 1983-12-16
A tetrazolium salt has been used to develop a quantitative colorimetric assay for mammalian cell survival and proliferation. The assay detects living, but not dead cells and the signal generated is dependent on the degree of activation of the cells. This method can therefore be used to measure cytotoxicity, proliferation or acti...阅读更多
F Denizot, R Lang
Journal of Immunological Methods 1986-05-22
A convenient way to estimate the number of viable cells growing in microtitre tray wells is to use a colorimetric assay and an automatic microplate scanning spectrophotometer. One such assay, developed by Mosmann, depends on the reduction by living cells of tetrazolium salt, MTT, to form a blue formazan product. However the orig...阅读更多
J Carmichael, W G DeGraff, A F Gazdar, J D Minna, J B Mitchell
Cancer Research 1987-02-15
Drug sensitivity assays were performed using a variation of a colorimetric [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)] assay on V79, CHO-AuxB1, CHRC5, NCI-H460, and NCI-H249 cell lines following optimization of experimental conditions for each cell line. Results from this assay were compared with data as...阅读更多