离心分离

来源:Mark FreiBioFiles v6 n5, 6–7

 BioFiles Volume 6, Number 5 — Centrifugation

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用于分离颗粒的离心技术有两种:差速离心和密度梯度离心。密度梯度离心法可以进一步分为速率区带法和等密度离心法。

差速离心法
速率区带离心法
等密度离心法
选择合适的密度梯度介质
选择表
参考文献


 离心分离中的差速离心法

离心分离的最简单形式是差速离心法,有时亦称为差速造粒法(见图1)。悬浮液中不同密度或大小的颗粒将以不同的速率沉降,粒径较大和较致密的颗粒沉淀得更快。沉降速率可用离心力来增加。细胞悬液经过一系列离心周期,随着离心力逐渐增加,细胞按大小或密度依次产生细胞沉淀团,从而达到分离目的。



差速离心

图1 差速离心
不同密度或粒径的颗粒将以不同的速率沉淀,粒径最大和最致密的颗粒沉降速度最快,其次是密度较低和粒径较小的颗粒。

差速造粒通常用于从组织匀浆中获取细胞或生成粗的亚细胞组分。例如,将含有细胞核、线粒体、溶酶体和膜囊泡的大鼠肝匀浆,短时低速离心后,较大和较致密的细胞核先发生沉淀。随后,以较高离心力离心将沉降较小粒径的颗粒(例如线粒体),以此类推。一般不会对正常的组织匀浆使用超过四个差速离心循环。

由于生物颗粒的异质性,差速离心法易受污染且回收率低。可通过重悬和再离心(例如洗涤沉淀团)来解决不同颗粒类型的污染。1

 离心分离中的速率区带离心法

在速率区带离心法中,密度梯度液顶部的狭窄样品区带被分层,从而避免不同沉降速率的颗粒之间交叉污染问题。(见图2)。以此方式,较快沉淀的颗粒不会像差速离心法中那样混入较慢的颗粒。然而,由于上样区带狭窄,因此限制了可容纳在密度梯度液之上的样品量(通常为10%)。梯度液可以稳定区带,并且可以增加密度和粘度。

 

速率区带离心

图2. 速率区带离心
样品在密度梯度液之上形成一层狭窄区带(2B)。在离心力作用下,颗粒根据其质量大小以不同的速率移动(2C)

颗粒沉降的速度主要取决于它们的粒径和质量而非密度。当区带中的颗粒向下移动通过密度介质时,移动速度较快的颗粒就会先于移动较慢的颗粒,从而形成含有类似大小颗粒的各个区带。由于颗粒的密度大于梯度液的密度,如果离心时间足够长,所有颗粒最终都会形成沉淀团。2

 离心分离中的等密度离心法

等密度分离亦称为浮力或平衡分离,在这种方法中,颗粒仅基于它们的密度分离。粒径仅影响颗粒在移动到其密度与周围梯度介质密度相同区带的速率。梯度介质的密度必须大于待分离颗粒的密度。通过此方法,无论离心时间多长,颗粒都不会沉淀到管底部(见图3)。


等密度离心


图3. 等密度离心
离心开始之前,样品颗粒与密度梯度液均匀混合在一起(3A),在离心力作用下,颗粒开始移动,直到其密度与周围介质密度相同(3B)。

离心时,特定密度的颗粒将一直沉降至与梯度介质密度一样的位置(即平衡位置)。此时的梯度液被称为达到等密度状态,颗粒都按照其浮力被分离。由于生物颗粒的密度对梯度液的渗透压敏感,因此等密度分离效果会随所用的梯度介质的不同而显著不同。尽管连续梯度液可能更适合于分析目的,但制备技术通常使用不连续梯度液,其中颗粒区带处于密度梯度层之间。这样更易于获取某些生物颗粒(例如淋巴细胞)。
 

 离心分离中的选择合适的密度梯度介质

密度梯度离心法的主要功能是根据颗粒的浮力密度或沉降速率分离颗粒。在速率区带分离法中,梯度液的作用是提供粘度梯度,以改善颗粒分离分辨率,同时使液柱稳定,不受对流影响。在等密度分离法中,梯度液的重要特点是梯度介质的最大密度要高于颗粒的密度。理想的密度梯度介质具有以下属性:3

  • 具有足够的溶解性,以产生所需的密度范围
  • 在所需的密度范围内不会形成高粘度溶液
  • 对于渗透压敏感型颗粒,密度梯度介质不是高渗或低渗性的
  • 梯度液应可调节pH值和离子强度,以适应要分离的颗粒
  • 不影响样品生物活性
  • 无毒且不会被细胞代谢
  • 不干扰测定流程或与离心管发生反应
  • 具有可用来衡量浓度的属性
  • 易于从纯化的产物中去除
  • 可高温高压灭菌
  • 成本合理

任何单一化合物都无法满足上述所有标准。
因此,为了适应不同类型的样本,有范围广泛的梯度介质可供选用(见表1)。
大多数介质能够提供所需的密度范围,并易于从目标颗粒中去除。

渗透性对生物颗粒的影响需要特别考虑。
大多数哺乳动物液体的渗透度为290-300 mOsm。4 此为平衡盐溶液(例如0.85-0.9% NaCl)和最常见介质的渗透度。 高渗溶液不仅会去除有膜颗粒内部的水分,还可以去除结合在DNA这样的大分子上的水分。
细胞水分流失会减小细胞的大小,增加它们的密度,从而影响它们的浮力和沉降速度。
虽然对细胞和大分子的渗透作用可能是可逆的,但它是一个造成错误的可能来源,应当避免。

多年来,为了改进分离技术,克服渗透性和粘稠性问题,已经开发出多种不同的化合物作为密度梯度介质。
密度梯度介质有五大类:

  • 多羟(糖)醇
  • 多糖
  • 无机盐
  • 碘化合物
  • 硅胶

表1. 密度梯度介质类型及其主要用途。

梯度介质类型 主要用途
多羟基醇
蔗糖 蔗糖细胞器,膜囊,病毒,蛋白质,核糖体,多核糖体
甘油 哺乳动物细胞(不常用),蛋白质
山梨醇
山梨醇非哺乳动物亚细胞颗粒
多糖
Ficoll®,聚蔗糖和聚萄糖
哺乳动物细胞(有时与碘化密度梯度介质结合),哺乳动物亚细胞颗粒(不常用)
无机盐
CsCl DNA,病毒,蛋白质
Cs2SO4 DNA, RNA
KBr 血浆脂蛋白
碘化梯度介质
泛影酸盐 主要用作商用淋巴细胞分离介质的组分
Nycodenz®, Histodenz™ 哺乳动物细胞,细胞器,膜囊,病毒
碘克沙醇 哺乳动物细胞,细胞器,膜囊,病毒,血浆脂蛋白,蛋白质,DNA
硅胶介质
Percoll® 哺乳动物细胞,细胞器,膜囊(不常用)

 

 离心分离中的选择表

 

名称 应用 细胞 细胞器 病毒 大分子
ACCUSPIN™ 适用于分离来自人外周血或骨髓的单核细胞。      
氯化铯 用于制备密度梯度离心溶液,适用于从 DNA分离RNA。
 可用于分离核糖体亚基、蛋白质、糖蛋白和病毒。
   
葡聚糖 用于制备白细胞丰富的血浆。      
硫酸葡聚糖 用于沉淀脂蛋白。      
泛影酸 与聚蔗糖400结合使用,产生能够纯化活细胞和细胞片段的密度梯度液。      
Ficoll® 蔗糖的非离子合成聚合物。用于细胞分离和细胞器分离。亦请参见聚蔗糖400。    
Histodenz® 用作非离子密度梯度介质。
 可高温高压灭菌,是推荐用于分离大分子、核蛋白、细胞器及各种细胞和病毒的通用离心介质。
Histopaque® 1077 适用于分离来自人外周血或骨髓的单核细胞。
 在细胞培养中,用来将活细胞和死亡细胞分离。
     
Histopaque® 1083 适用于分离来自大鼠、小鼠或其他哺乳动物外周血或骨髓的单核细胞。      
Histopaque® 1119 与Histopaque 1077结合使用,用于分离来自人外周血或骨髓的粒细胞和单核细胞。      
泛影葡胺 与泛影酸钠结合使用,可分离多种细胞和细菌孢子。      
OptiPrep™ 密度梯度介质 60% (w/v) 碘克沙醇水溶液(无菌)。
 密度梯度液,适用于分离细胞和细胞器、以及病毒和蛋白质。
Percoll® 具有近乎理想的物理特性,适用于分离细胞、病毒、细胞器和其他亚细胞粒子。Percoll在整个梯度范围上是等渗的,无毒,并且易于从纯化的材料中去除。 它以无菌胶态悬浮液的形式提供,由粒径为15-30nm、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)包被的二氧化硅颗粒组成。
聚蔗糖 400 蔗糖的非离子合成蔗糖的非离子合成聚合物。
 用于细胞分离和细胞器分离。
 可用于增加红细胞的沉降率。
 作为蛋白质溶液的稳定剂。可用于制备密度梯度液和高密度溶液。
   
泛影酸钠 与聚蔗糖400结合使用,产生能够纯化活细胞和细胞片段的密度梯度液。 也可用于获得完整的白细胞悬浮液,并分离和制备纯凝血细胞和网织红细胞。      
蔗糖 用来制备梯度液,用于各种速率区带分离和等密度分离。
 可用于蛋白质、核酸、核糖体和多核糖体的纯化。当细胞活性不是必要要求时,可用于细胞分离。
     

 

 参考文献

  1. Biological Centrifugation, J. Graham, p. 5.
  2. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, P.T. Sharpe, p. 24.
  3. ibid., p.26.
  4. Biological Centrifugation, J. Graham, p. 24.