胶原酶组织消化/解离问题解决及参考文献

BioFiles 2006, 1.2, 6.


 组织消化 — 胶原酶解离

 

问题 原因 解决方法 参考文
消化差
 
 
 
非活性酶
 
Ca++ 不足
酶不足
胶原酶冷藏干燥保存。
将胶原酶溶液储存在冷冻的等分试样中
在胶原酶溶液中加入 5 mM Ca++
使用更多胶原酶。尝试我们蛋白酶活性更高的混合物。
1 
 
2 
 
释放的细胞被捕获
 
 
 
 
破碎细胞释放的 DNA
 

非蛋白胶
 
 
减少扰动
添加 DNase**
消化前充分冲洗组织***
在消化液中不使用 Mg ++
加入透明质酸酶与酶**
2 
3 
2 
2 
4
细胞被杀死
 
 
 
 
 
过量蛋白酶
 
pH 值变化
 
氧气过少
 
减少蛋白酶的接触*
加入白蛋白或加热血清
使用缓冲区(如 HEPES)代替 HCO -3
经常检查和重新调节 pH 值
充气消解液(空气或 O2
用更多的酶更快地消化
 
 
2 
 
5 
 
细胞产量低
 
 
酶平衡
 

粘附因子
使用更多胶原酶 *
含胶原酶的弹性蛋白酶 **
首先灌注组织以去除 Ca++***
 
6 
2,8
许多细胞受损
 
 
蛋白酶过多
 

物理损伤
少用蛋白酶*
加入白蛋白或加热血清
非常小心地处理组织和细胞
7 
 
2,8
新批次无效
 
批次变化
 
使用我们经过分馏的混合胶原酶
(类别号: C7926, C8051 或 C8176)*
 
 

* 在我们的混合产品中单独制备的胶原酶和蛋白酶(类别编号 C7926C8051 或 C8176)可重复地控制每种药物的用量。

** 过度搅拌的剪切力会使 dna 酶失活,添加的酶可能被胶原酶中存在的中性蛋白酶消化。

*** 使用 EGTA(或 EDTA)去除 Ca2+ 并冲走微生物,然后用缓冲液清洗组织以去除螯合剂。酶溶液中不要加入 EGTA 或 EDTA。


 胶原酶影响组织消化-解离的因素

基于我们自己的研发,并从与客户的讨论中可以清楚地看出,特定组织的解剖和制备方式对任何组织消化——胶原酶解离的速度和效率都有显著影响。组织供体年龄的差异也可能是长期范围内的主要变化来源。确保钙离子以 5 mM 存在于消化缓冲液中。螯合剂 EGTA 和 EDTA 可通过去除酶稳定性和活性所需的钙离子而严重抑制胶原酶活性。其他抑制物质还有β-巯基乙醇、9 半胱氨酸9 和 8-羟基喹啉-5-磺酸盐9 。新一批具有较高比活性的胶原酶在一定浓度下可引起细胞过度死亡。在这种情况下,应使用较少的胶原酶和/或添加 BSA 或血清(分别高达 0.5% 和 5-10%)来稳定消化过程中的细胞。


 材料

     


 参考文献

  1. Fain, J.N., Meth. Enzymol., 35, 555 (1975)
  2. Seglen, P.O., Methods in Cell Biology, 13, 29 (1976)
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  4. Berry, M.N., and Friend, D.S., J. Cell Biol., 43, 506 (1969)
  5. Bellemann, P., et al., Anal. Biochem., 81, 408 (1977)
  6. Ives, H.E., et al., J. Expt. Med., 148, 1400 (1978)
  7. Fain, J.N. and Loken, S.C., J. Biol. Chem., 244, 3500 (1969)
  8. Berry, M.N., et al., Isolated Hepatocytes; Preparation, Properties and Applications. Elsevier. 1991
  9. Seifter, S., et al., J. Biol. Chem., 234, 285 (1959)