去垢剂的性质和应用

来源: Vicki Caligur, BioFiles 2008, 3.3, 14.

去垢剂功能的关键是具有两亲结构。所有的去垢剂都具有亲水“头部”区域和疏水“尾部”区域这一特征(见图1)。

阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)的结构,包含疏水区域和亲水区域。

图1. 阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)的结构,包含疏水区域和亲水区域。

这些结构特性使得去垢剂可以在水性介质中聚集。在足够高的浓度下,每个分子的极性亲水区域朝向极性溶质(水),而疏水区域聚集在一起,形成一个具有疏水核心的热力学稳定的胶束。去垢剂胶束的疏水核心区域与蛋白质的疏水表面结合,形成可溶性的蛋白质-去垢剂复合物。图2是胶束的一个简单图例,用于演示朝向这一概念。实际的胶束结构是更复杂和动态的,并可以根据去垢剂的浓度和溶液的组成而变化。1

十二烷基硫酸钠胶束的简单图例。

图2. 十二烷基硫酸钠胶束的简单图例。

生物去垢剂通常用于破坏细胞的双极脂质膜,从而释放和溶解膜结合蛋白。一些去垢剂可被用于溶解重组蛋白,而另一些则被用于蛋白质的稳定、结晶和变性。去垢剂可以在水/非水界面处排列,从而降低表面张力,增加混溶性并稳定乳状液。其他的去垢剂应用包括:

  • 提取DNA和RNA
  • 溶解标本用于诊断应用
  • 细胞裂解 
  • 脂质体制备
  • 防止溶液中的试剂和被分析物沉淀
  • 防止免疫测定中的非特异性结合


 去垢剂的物理特性

胶束开始形成时的浓度被称作临界胶束浓度(CMC)。CMC是单体的最大浓度,并且可以因此对形成胶束的自由能进行量度。CMC越低,胶束越稳定,并且分子并入胶束或脱离胶束的速度越慢。去垢剂疏水区域的结构会影响胶束的结构。离子型去垢剂疏水烃链的长度增加会导致胶束增大和CMC降低,同时构建胶束需要的分子也减少。

胶束中单体的平均数量被称作聚集数。CMC和聚集数的值很大程度上取决于以下因素:温度、pH、离子强度以及去垢剂的均一性和纯度。用来测定CMC和聚集数的分析方法的不同可能会造成报道数值的轻微差异。聚集数的值也会因浓度而变化,当浓度高于CMC时,单位胶束中的去垢剂分子数目会增加。

易于去除或交换是选择去垢剂时需考虑的一个重要因素。一些常见的去除去垢剂的方法包括:

  • 透析 
  • 凝胶过滤色谱
  • 疏水吸附色谱
  • 蛋白沉淀

去垢剂相关的CMC值是疏水结合强度的重要参考。去垢剂的CMC值越高其结合越弱,相应的也越容易通过透析或置换方法去除。而CMC值较低的去垢剂则只需要较少的去垢剂就可以形成胶束并溶解蛋白质或脂质。 

另一个用于评估后续去除去垢剂难易度的有用参数是胶束分子量,它表示相对胶束大小。越小的胶束越容易去除,在基于蛋白质分子尺寸的蛋白质-去垢剂复合物分离时效果也更理想。胶束分子量可以用单体分子量乘上聚集数来计算。

浊点是指当浓度接近或高于CMC时,去垢剂溶液分离成两相的温度。胶束聚集,形成高去垢剂浓度的混浊相,而溶液达到平衡点时会耗尽去垢剂。得到的两相溶液可以被分离,提取出的蛋白质位于富含去垢剂的相中。因为高浊点温度会造成溶解蛋白质的变性,因此在蛋白质存在时推荐使用低浊点的去垢剂,例如TRITON® X-114 (浊点~23 °C)。去垢剂浓度和温度的变化以及添加盐或聚合物(例如葡聚糖和聚乙二醇)等因素都会影响浊点。需要注意的是富含去垢剂的相也取决于去垢剂的种类和盐浓度;在某些条件下,相可以是澄清的而不是混浊的,可以作为溶液的上相或下相。对于非离子型去垢剂,这点已被用于膜蛋白的相分离和提纯。2 


 去垢剂的种类和选择

选择去垢剂时,首先需要考虑的通常是亲水基团的组成:

阴离子阳离子去垢剂被认为是生物学上的“严苛的”去垢剂,因为相对于中性的去垢剂,它们会更大程度的改变蛋白质的结构。变性程度随着蛋白质个体的不同以及去垢剂的种类和浓度的变化而变化。离子型去垢剂更容易受到pH、离子强度和反离子的性质等因素影响,并可能会干扰下游的基于电荷的分析方法。

非离子型去垢剂被认为是“温和的”去垢剂,因为它们并不会像离子型去垢剂那样使得蛋白质变性。由于不分离蛋白质-蛋白质键,非离子型去垢剂使得蛋白质可以保留其天然的结构和功能,尽管疏水链长度较短的去垢剂更易引起蛋白质失活。大部分非离子型去垢剂可以被分为以下三种结构类型:

  • 聚(氧乙烯)醚和相关聚合物
  • 胆盐 
  • 糖苷类去垢剂

聚(氧乙烯)醚和相关聚合物具有一个中性的极性头部以及疏水的尾部,比如氧乙烯聚合物(如Brij®和TWEEN®)或乙二醇醚类聚合物(如TRITON®)。叔辛基酚聚(乙二醇)系列的去垢剂,包括TRITON X-100和IGEPAL® CA-630,具有一个可以干扰下游UV分析技术的芳香头部。

胆盐具有一个极性或非极性取向的类固醇核心结构,而不是其他去垢剂所具有的更为明显的非极性尾部结构。相对于具有同样极性头部基团的线性链去垢剂,胆盐更少产生变性。

糖苷类去垢剂以一个碳水化合物(通常为葡萄糖或麦芽糖)作为极性头部,以7-14个碳长度的烷基链作为极性尾部。 

两性去垢剂同时具有离子型和非离子型去垢剂的特点。相对于离子型去垢剂,两性去垢剂更少产生变性,且与非离子型去垢剂一样具有一个净的中性电荷。相对于非离子型去垢剂,两性去垢剂可以更有效的破坏蛋白质-蛋白质键并减少聚集。这些性质已被用于色谱、质谱和电泳方法,以及细胞器和包涵体的溶解中。

非去垢剂磺基甜菜碱(NDSB)虽然不是去垢剂,却具有和两性去垢剂类似的亲水基团,但其疏水链较短。磺基甜菜碱不会形成胶束。据报道,当它们与去垢剂联合使用时,可以提高膜蛋白的产量并防止变性蛋白的聚集。 

 


 参考文献

关于去垢剂的更多性质和应用,请查阅下列参考文献。

A Helenius, D R McCaslin, E Fries, C Tanford
Methods in Enzymology 1979-01-01
J M Neugebauer
Methods in Enzymology 1990-01-01
L M Hjelmeland
Methods in Enzymology 1990-01-01
F A Marston, D L Hartley
Methods in Enzymology 1990-01-01
L M Hjelmeland
Methods in Enzymology 1990-01-01
Annela M Seddon, Paul Curnow, Paula J Booth
Biochimica et Biophysica Acta 2004-11-03
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Gilbert G Privé
Methods 2007-04-01
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